籽瓜种子蛋白质的持水及持油性研究

邓芝串 张 晖 张 超 王 立 钱海峰 齐希光

（江南大学食品学院1，无锡 214122）

（北京市农林科学院蔬菜研究中心2，北京 100097）

籽瓜种子蛋白质的持水及持油性研究

邓芝串1张 晖1张 超2王 立1钱海峰1齐希光1

（江南大学食品学院1，无锡 214122）

（北京市农林科学院蔬菜研究中心2，北京 100097）

以籽瓜种子为原料，采用碱溶酸沉法提取籽瓜种子蛋白质。测定并比较籽瓜种子蛋白和大豆浓缩蛋白的持水及持油性。探究蛋白质、氨基酸组成及含量、表面疏水性及蛋白质的超微结构与持水及持油性的关系。结果表明：籽瓜种子蛋白的持油性是大豆浓缩蛋白的1.1～1.2倍，持水性较差，仅是大豆浓缩蛋白的0.65～0.7倍；籽瓜种子蛋白以球蛋白和难溶蛋白为主，分别占总蛋白的58.79%和24.15%，球蛋白对持油性不利，难溶蛋白则能增强持油性；籽瓜种子蛋白具有较高的表面疏水性，其疏水指数为440，大豆浓缩蛋白较低为354，较高的表面疏水性能有益于持油性，降低持水性；结构疏松、存在空洞缝隙的海绵状蛋白结构对持水性和持油性有利。

籽瓜种子 蛋白质 持水性 持油性 结构特性 理化特性

籽瓜又称“打瓜”，外形与西瓜相似但比西瓜略小，属葫芦科普通西瓜亚种的变种，我国籽瓜主要产区为吉林、山西、内蒙古等地，年产量为百万t以上［1］。籽瓜种子中蛋白质含量为36%～40%，蛋白质含有丰富的必需氨基酸，除赖氨酸外，其他必需氨基酸均达到或超过FAO规定的标准［2－3］，是一种优质的植物蛋白质资源，在食品加工领域有着广阔的前景。蛋白质的持水及持油性是蛋糕、肉制品、面包、冰激凌等食品加工过程重要的特性和质量控制指标［4］，对于风味食品来说，蛋白质持油性可以提高食品对脂肪的吸收与持留能力，改善食品的适口性及风味［5］。目前对籽瓜种子蛋白质的研究较少，张玉秀等［2］对其氨基酸组成进行了系统的评价和比较；张超等［6］优化了提取籽瓜种子蛋白质的工艺。

本试验通过碱溶酸沉法提取籽瓜种子蛋白质，测定并对比了籽瓜种子蛋白质和大豆浓缩蛋白质的持水及持油性，探究并分析了蛋白质的理化及结构特征与蛋白质持水及持油性的关系，为籽瓜种子蛋白质的深入研究及其在食品加工中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

民籽一号黑籽瓜种子：甘肃省民勤县金谷源农业科技有限公司；福临门一级大豆油：中粮集团；大豆浓缩蛋白质：上海娇源集团；1－苯氨基萘－8－磺酸（ANS）：Sigma标准试剂公司；分析纯氯化钠、氢氧化钠、浓盐酸、浓硫酸、正己烷、乙醇等：国药集团化学试剂有限公司

1.2 仪器设备

CR21GⅢ 高速冷冻离心机：日本日立公司；冷冻干燥机：美国Laboconcor公司 ；Delta 320 pH计：梅特勒 －托利多（上海）仪器有限公司；F－7000型荧光光谱仪：日本 HITACHI公司；Nicolet is10傅里叶变换红外光谱仪：美国赛默飞公司；日立S－4800场发射扫描电子显微镜：日本日立株式会社；安捷伦1100型液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 籽瓜种子蛋白质的提取及纯度测定

籽瓜种子手动脱壳，万能粉碎机粉碎种仁，按1∶4（W／V）比例用正己烷脱脂（温度 50℃，时间8 h），于通风橱中干燥8 h，再于鼓风干燥箱中50℃干燥12 h，过60目筛备用。脱脂后籽瓜种仁粉末按1∶10（W／V）料液比加入去离子水，用 0.5 mol／L的NaOH溶液调pH至11.5，61.5℃下搅拌水浴浸提77 min，3 500 r／min、25℃离心 15 min，取上清液调pH至5.0使蛋白沉淀，8 000 r／min、4℃离心15 min得蛋白沉淀，用去离子水洗涤沉淀2～3次，调pH至7.0，在－46℃、0.05 Mbar下冷冻干燥24 h得籽瓜种子蛋白质［6］，粗蛋白含量按 GB／T 5009.5—2010测定。

1.3.2 籽瓜种子蛋白质持油性的测定

依据文献［7］的方法，并做适当改动：取0.5 g蛋白样品与6 mL大豆油混匀，静置30 min，3 000 r／min室温离心25 min，移除上清液，沉淀称重，按式（1）计算持油性。

1.3.3 籽瓜种子蛋白质持水性的测定

依据文献［8］的方法，并做适当改动：取3 g蛋白样品与25 mL的去离子水混合，每隔10 min搅拌1次，每次1 min，共6次。后于3 000 r／min室温离心25 min，移除上清液，沉淀于50℃干燥25 min称重，按式（2）计算持水性。

1.3.4 蛋白质氨基酸组成及含量的测定

称取一定量的蛋白样品于20 mL水解管中，加入10 mL 6 mol／L的HCl溶液，抽真空至7 Pa后封口。将水解管置于110℃恒温烘箱内水解24 h后冷却，混匀，开管，过滤，吸取适量滤液，60℃抽真空蒸干，加入3～5 mL pH 2.2的柠檬酸钠缓冲液，摇匀，离心，取上清液，以外标法于安捷伦AG1100型氨基酸专用液相色谱仪定量测定［9］。具体色谱条件：色谱柱为ODSHYPERSIL；柱温40℃；流动相A：称取8.0 g乙酸钠，加入1 000 mL水搅拌溶解，再加入225 μL三乙胺，用5%的醋酸调pH至7.20，加入5 mL四氢呋喃，混合后备用；流动相B：称取12.0 g乙酸钠，加入400 mL水搅拌溶解，用5%醋酸调pH至7.20，加入800 mL乙腈和800 mL甲醇，混合后备用；紫外检测器：338 nm、262 nm。洗脱条件如表1所示。

表1 氨基酸测定梯度洗脱表

1.3.5 蛋白质组分分析

通过Osboren［10］法测定籽瓜种子蛋白质中各组分的含量：取一定量脱脂籽瓜种子粉末，按1∶10（W／V）加入去离子水，室温搅拌浸提60 min后于3 500 r／min离心20 min，取上清液测定清蛋白含量。所得沉淀加入5%NaCl溶液搅匀，室温搅拌浸提60 min后于3 500 r／min离心20 min，取上清液测定球蛋白含量。所得沉淀加入75%乙醇混匀，室温浸提60 min后于3 500 r／min离心20 min，取上清液测定醇溶蛋白含量。所得沉淀加入0.2%NaOH溶液混匀，室温浸提60 min后于3 500 r／min离心20 min，取上清液测定谷蛋白含量。所得沉淀测定其蛋白含量，为难溶性蛋白质［11］。

1.3.6 蛋白质表面疏水性的测定

依据Paulson等［12］使用的ANS法：用1－苯氨基萘－8－磺酸（ANS）作为荧光探针。用pH 7的磷酸盐缓冲液，配制一系列浓度的蛋白质溶液，浓度范围0.000 5～0.015 mg／mL。取2 mL不同浓度的蛋白溶液加入10μL的 ANS溶液（8.0 mmol／L，pH 7的磷酸盐缓冲液配制），立即采用F－7000型荧光光谱仪在390 nm的激发波长（狭缝1 nm）和470 nm的发射波长下，以未加ANS溶液的蛋白溶液做空白，测定样品的荧光强度FI。以荧光强度对蛋白浓度做曲线，曲线初始阶段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水活性S0。

1.3.7 蛋白质超微结构分析

取少量冻干的蛋白质样品，用1%的四氧化锇固定1 h，经过离子溅射仪喷金处理后，置于日立S－4800场发射扫描电子显微镜下，放大2 000×和10 000×的条件下进行观察、拍照，分析蛋白质的超微结构［13］。

1.4 数据处理

试验所涉及到的测定结果均做3次平行，试验数据用Origin 8.6进行处理，用SPSS软件进行显著性分析处理。

2 结果及讨论

2.1 籽瓜种子蛋白质的含量

由表2可知，碱溶酸沉法制得的籽瓜种子蛋白冷冻干燥后，含量与市售大豆浓缩蛋白相似，大豆浓缩蛋白作为食品中常用蛋白添加剂具有良好的功能性质，在工业上应用广泛。本试验以市售大豆浓缩蛋白作对比，目的是更好地了解籽瓜种子蛋白的持水及持油性，为其应用提供理论基础。

表2 籽瓜种子蛋白质的纯度

2.2 籽瓜种子蛋白质的持油性

由图1和图2可知，籽瓜种子蛋白的持油性明显比大豆浓缩蛋白好，是大豆浓缩蛋白的1.1～1.2倍。由图1可知，蛋白质的持油性随温度的升高先增加后降低，籽瓜种子蛋白和大豆蛋白的持油性均在30℃的时候达到最大值，分别为172.12 g／100 g、156.09 g／100 g，这是因为随着温度的升高，蛋白质的空间结构不断伸展打开，部分疏水基团暴露，蛋白质的持油性增加。当温度超过30℃时，油的流动性增加，导致持油性降低［13］。由图2可知，蛋白质的持油性随着维持时间的增加先升高后保持稳定。因为当时间达到50～60 min时，籽瓜种子蛋白和大豆浓缩蛋白因为不同的理化与结构特性导致蛋白质的持油性均达到了不同的饱和状态，分别为177.5 g／100 g、157.63 g／100 g，当时间继续增加时，蛋白质的持油性不再增加［14］。

图1 温度对持油性的影响

图2 持油时间对持油性的影响

2.3 籽瓜种子蛋白质的持水性

由图3～图5可知，籽瓜种子蛋白的持水性明显低于大豆浓缩蛋白，仅是大豆浓缩蛋白的0.65～0.7倍。由图3可知在30～80℃范围内，持水性随着温度的升高而增加，这是因为适当的升温使蛋白质的结构伸展、膨松，蛋白质与水分子间作用力增大，提高了蛋白的持水性。当温度达到80℃时，籽瓜种子蛋白和大豆浓缩蛋白的持水性达到最大值，分别为384.62 g／100 g、792.72 g／100 g。但当温度超过 80℃时，蛋白质变性发生聚集、大量的疏水基团暴露，使蛋白的持水性下降［14－15］。图4可知NaCl浓度对2种蛋白的持水性影响均不大。由图5可知，pH对蛋白持水性的影响较大，在等电点附近籽瓜种子蛋白和大豆浓缩蛋白的持水性最低分别为322.32 g／100 g、511.89 g／100 g，但当 pH大于 7时，蛋白质的持水性随pH的增加而降低，大豆浓缩蛋白的持水性由pH为7时的546.3 g／100 g减少为pH为9时的488.29 g／100 g，而籽瓜种子蛋白的持水性由pH为7时的377.14 g／100 g减少为pH为9时的355.1 g／100 g，这是由于pH升高，改变了蛋白质的带电荷数，使蛋白质的溶解度增加，从而导致实测的持水性下降［16］。

图3 温度对持水性的影响

图4 NaCl浓度对持水性的影响

图5 pH对持水性的影响

2.4 籽瓜种子蛋白质的氨基酸组成及含量

表3中K－D法：氨基酸残基的疏水参数是Kyte等［17］同时考虑氨基酸在有机溶剂和水中的分配系数，以及氨基酸在蛋白质结构中的分布2个方面总结而成，负值越大，疏水性越差，亲水性越强。理论上，组成蛋白质的氨基酸中残疏水性氨基酸残基含量越多，蛋白质持油性好的可能越大。由表3可知：从氨基酸的组成和含量上看，2种蛋白质中疏水性强的非极性氨基酸异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸的含量和亲水性强的氨基酸含量并无明显差异，相反，从非极性氨基酸残基与强极性氨基酸的比例来讲，籽瓜种子蛋白质的为35.5%，大豆蛋白质的为39.9%。但极性与非极性氨基酸在蛋白质表面的分布，却有明显差异，籽瓜种子蛋白质中，更多的非极性氨基酸分布在其表面形成疏水基团［18］，使该蛋白质对游离脂的亲和力加强，对水的亲和力减弱，而大豆蛋白则与之相反。

表3 籽瓜种子蛋白质的氨基酸组成及含量

2.5 籽瓜种子蛋白质组成

由表4可知，籽瓜种子蛋白中球蛋白的含量相对较低，为58.79%，大豆浓缩蛋白中球蛋白的含量则较高，为65.53%。在球蛋白中，由于疏水相互作用，疏水基团相互靠拢并趋于蛋白质分子内部，亲水基团则多分布于球蛋白表面，从此方面来说球蛋白含量越多，对蛋白质的持油性越不利，对持水性越有利。同时，籽瓜种子蛋白中清蛋白的含量也较低，为10.64%，清蛋白是一种可溶性蛋白，亲水性强，容易持留更多的水，所以清蛋白含量越多越不利于蛋白质的持油性，而对蛋白质的持水性有利。籽瓜种子蛋白质中具有24.15%的难溶性蛋白质，难溶性蛋白质之所以难溶是因为蛋白表面存在的大量疏水基团，可以束缚更多的脂肪烃链，进而增加了籽瓜种子蛋白质对油的持留作用［19］。

表4 籽瓜种子蛋白的蛋白质组成／%

2.6 籽瓜种子蛋白质的表面疏水性

如图6所示，籽瓜种子蛋白的表面疏水性比大豆浓缩蛋白好，其中籽瓜种子蛋白质的表面疏水指数为440，而大豆蛋白为354，说明在蛋白质的表面有更多的非极性氨基酸残基暴露，形成疏水区域［20］，使蛋白质对水的亲和力下降，对游离脂的亲和力增加，有利于蛋白质的持油性，这与Nasri［21］研究报道疏水性可以增加蛋白质的持油性相一致。

图6 蛋白质的表面疏水活性

2.7 籽瓜种子蛋白质的超微结构

由图7和图8可知，籽瓜种子蛋白具有较为疏松的超微结构，蛋白质表面是类似蜂窝状的片层空洞结构，并且籽瓜种子蛋白之间相互交联产生了很多疏松的缝隙和孔洞，有利于油滴和水滴的进入。由图6可知，籽瓜种子蛋白质空洞和缝隙的表面具有较多的疏水基团有利于蛋白质的持油性［22］，但表面过多的疏水基团会排斥水分子的进入，使持水性降低。由图9和图10可知，大豆蛋白为较为松散的球状蛋白，蛋白质表面比较光滑，蛋白质之间相互交联很弱大豆蛋白的表面疏水较差，而较差的表面疏水性使蛋白质与油的疏水相互作用较弱，不利于大豆蛋白质对油的吸收及维持，反之较弱的疏水性，有利于蛋白质与水的结合，对蛋白质的持水性有利［23－24］。

图7 籽瓜种子蛋白质的扫描电镜图（2 000×）

图8 籽瓜种子蛋白质表面的扫描电镜图（10 000×）

图9 大豆浓缩蛋白质的扫描电镜图（2 000×）

图10 大豆浓缩蛋白质表面的扫描电镜图（10 000×）

3 结论

与大豆浓缩蛋白质相比，籽瓜种子蛋白质的持油性较好，但持水性较差。除NaCl浓度对蛋白质的持水性影响不大之外，温度、pH、维持时间等因素对籽瓜种子蛋白质的持水和持油性均有较大的影响。籽瓜种子蛋白质的持水性和持油性是蛋白质多种理化、结构特性共同作用的结果，不仅与氨基酸组成及含量有关，而且与极性和非极性氨基酸的分布有关，表面的非极性氨基酸形成的疏水基团能增加蛋白质的持油性，而对持水性不利。籽瓜种子蛋白中含58.79%的球蛋白和24.15%的难溶蛋白，难溶蛋白能增加持油性，而球蛋白对持水性有利。籽瓜种子蛋白质具有较高的表面疏水性，能增加蛋白质对油的吸收及维持作用，降低蛋白质对水的吸收。籽瓜种子蛋白质结构疏松、存在大量的海绵状空洞缝隙有利于油和水分子的进入，但进入蛋白质的油和水分子能否被持留，仍与蛋白质的其他理化性质有关。

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Study on Water and Fat Absorption of Seed－watermelon's Seeds Protein

Deng Zhichuan1Zhang Hui1Zhang Chao2Wang Li1Qian Haifeng1Qi Xiguang1

（School of Food Science and Technology，Jiangnan University1，Wuxi 214122）（Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences2，Beijing 100097）

Protein has been extracted from seed－watermelon's seeds by alkali extraction and acid precipitation method in the paper.The retention and fat absorption of seed－watermelon's seeds protein have been evaluated and the soybean protein concentrate were also compared.The relationship of composition，count of protein and amino acid，surface hydrophobicity，ultrastructure of proteins and the retention and fat absorption of protein were studied respectively.The results showed that the fat absorption of seed－watermelon's seeds protein could be 1.1～1.2 times of that of soybean protein concentrate，but the retention was not as well as the fat absorption，which was only 0.65～0.7 times；protein of seed－watermelon's seeds mainly included globulin and insoluble protein，which accounted for 58.79%and 24.15%of total protein respectively.The existence of globulin had a passive effect on fat absorption，while insoluble protein increased the fat absorption；protein of seed－watermelon's seeds had high surface hydrophobicity of 440，while the soybean protein concentrate was only 354.The relatively higher surface hydrophobicity increased the fat absorption while reduced the retention；the protein with a loose spongy structure was satisfied for retention and fat absorption of protein.

seed－watermelon's seed，protein，retention，fat absorption，structural characteristics，physicochemical characteristics

TQ432.2

A

1003－0174（2015）09－0049－06

863计划（2013AA102203－07）

2014－03－31

邓芝串，男，1990年出生，硕士，粮食与植物蛋白

张晖，女，1966年出生，教授，谷物与健康食品