近红外荧光染料用于肿瘤检测的初步研究

田　迎，卢光明，郑　玲

近红外荧光染料用于肿瘤检测的初步研究

田迎，卢光明，郑玲

目的：体内外研究新型近红外荧光染料IR-808对肿瘤的检测作用，并初步探索其潜在的临床应用。方法：体外培养3种人肿瘤细胞（结肠癌细胞系HCT116、肺癌细胞系A549和乳腺癌细胞系MCF-7），与浓度为20 μmol/L的IR-808共孵育20 min，以正常人胚肾细胞系293T作为对照；建立乳腺癌皮下瘤动物模型，静脉注射剂量为1 mg/kg的IR-808，24 h后观察体内成像效果；收集1例恶性胸水标本，分别与同等浓度的染料孵育24和48 h，观察其荧光信号的稳定性，并与临床病理结果比较，判断其检测肿瘤细胞的效果。结果：体内外实验证明近红外荧光染料IR-808只靶向肿瘤成像；与胸水共孵育后，IR-808信号稳定，初步证实其能检测到标本中的肿瘤细胞。结论：IR-808具有良好的靶向肿瘤成像的性能，利用此性质可以用来检测临床标本中的肿瘤细胞，具有重要的应用前景。

近红外荧光染料IR-808；肿瘤；靶向成像

0　引言

恶性肿瘤一直是威胁人类健康和生命的重大疾病。目前，设计并制备无毒、靶向性能好且性能稳定的分子探针一直是研究的热点，对于临床上诊断肿瘤细胞，尤其是恶性积液肿瘤细胞尤为迫切[1-2]。临床上常规方法主要是细胞病理诊断和临床生化检查。细胞病理诊断一直被认为是检测肿瘤细胞的金标准，但是在某些形态结构相似的细胞类型，例如肿瘤细胞和间皮细胞，其检查存在误差性[3]。

最近，近红外（near-infrared，NIR）吲哚花菁染料以其特殊的靶向肿瘤近红外成像且荧光信号稳定、无需借助化学作用等优点受到广泛关注[4-6]。因此，本文选取新型近红外荧光染料IR-808，初步验证其特殊性能，首次尝试检测临床胸水中肿瘤细胞，开发其潜在的临床价值。

1　主要材料与方法

1.1主要材料与设备

近红外花菁染料IR-808由第三军医大学史春梦教授馈赠。细胞培养试剂均购自美国GIBCO公司，Xenogen IVIS小动物活体可见光成像系统购自美国Caliper公司，近红外荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2细胞培养

人胚肾细胞系293 T、肿瘤细胞系结肠癌细胞系HCT116、肺癌细胞系A549以及乳腺癌细胞系MCF-7均购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库，培养条件参考ATCC要求，于37℃、5%CO2培养箱中孵育，每48 h传代1次。细胞制成细胞爬片后分别与20 μmol/L IR-808及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），DAPI孵育20 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤后，用近红外荧光显微镜观察（激发光：684～719 μm；发射光：740～950 μm）。

1.3动物模型构建

实验动物BAIB/c—nu/nu雌性裸鼠10只购自南京军区南京总医院比较医学科，鼠龄6周，体质量18 g。动物随机分成2组，正常对照组（n=5）和皮下移植瘤组（n=5）。皮下瘤动物模型为乳腺癌动物模型，待乳腺癌细胞系MCF-7汇合度达到80%后，收集细胞，5×106个/只接种于裸鼠后背部皮下。2组动物分别尾静脉注射0.2 ml生理盐水和0.2 ml染料IR-808（生理盐水稀释，剂量为1 mg/kg）。24 h后用小动物活体可见光成像系统对模型小鼠进行X线扫描和近红外荧光成像。实验结束后解剖取组织再次进行近红外荧光成像。

1.4胸水检测

收集1例临床恶性肿瘤患者胸水标本，孵育IR-808后，可见光成像系统在24和48h时进行观察。分别与20 μmol/L IR-808及DAPI孵育20 min后，近红外荧光显微镜观察其靶向成像效果。

1.5病理染色

将收集的此例恶性胸水标本离心后沉淀浸泡在95%的酒精中，次日进行苏木素与伊红染色，进行细胞病理学分析。

2　结果

2.1近红外荧光成像系统观察IR-808对细胞的成像结果

将正常细胞系293T、结肠癌细胞系HCT116、肺癌细胞系A549及乳腺癌细胞系MCF-7与一定浓度的近红外荧光染料IR-808及DAPI孵育，IR-808标记肿瘤细胞，DAPI主要染细胞核。近红外荧光显微镜对其进行成像，不同细胞系的曝光时间及拍摄条件一致。如图1所示，IR-808仅靶向肿瘤细胞成像，而293 T细胞不成像；且肿瘤细胞品系之间没有明显差异，均能有较好的近红外成像效果。

2.2IR-808在正常小鼠及乳腺癌皮下移植瘤模型小鼠体内的分布

将生理盐水及IR-808分别尾静脉注射入正常小鼠及乳腺癌移植瘤模型小鼠，24 h后观察染料在小鼠体内的分布情况。实验结果发现IR-808逐渐靶向乳腺癌模型小鼠的肿瘤部位，周围组织信号相比肿瘤荧光信号区域较低，而正常小鼠没有明显的荧光信号的聚集。解剖小鼠，取肝脏、肺、脾脏、心脏、肾脏及肿瘤重要组织器官进行成像，发现只有肿瘤组织有较强的荧光信号，而包括肝、肾在内的其他组织无明显信号。离体组织与活体成像结果基本一致。在观察期间，小鼠活动、反应及食欲正常，体质量未见减轻，未见明显毒性反应（如图2～4所示）。

图1　正常细胞系293T、结肠癌细胞系HCT116、肺癌细胞系A 549及乳腺癌细胞系MCF-7分别孵育IR-808及DAPI的近红外显微镜观察结果

图2　正常小鼠X线成像及生物荧光成像结果

图3　移植瘤小鼠X线成像及生物荧光成像结果

图4　动物模型组织近红外成像结果

2.3IR-808对恶性胸水标本肿瘤细胞的检测结果

收集临床恶性胸水标本1例，与20 μmol/L IR-808及DAPI共孵育20 min，小动物活体成像系统检测胸水中肿瘤细胞的荧光信号稳定性。与IR-808共孵育后的胸水如图5所示，它显示出更强的荧光信号强度，没有孵育染料的标本并没有荧光信号产生；且24和48 h后其荧光信号仍然很稳定，有利于长期检测。近红外荧光显微镜检测胸水标本爬片结果，与DAPI染色结合，发现胸水中的肿瘤细胞被染上，而非肿瘤细胞没有被染上，进一步证实此染料的特异性。细胞病理染色结果与染料孵育结果一致，此染色方法有一定的正确性，其准确率需较多病例支持并作进一步统计分析。

图5　临床胸水标本孵育IR-808后近红外荧光信号检测结果

3　讨论

目前，生化瑞氏染色和细胞病理学诊断是临床上检测胸腹水中癌细胞最常用的方法。细胞病理学诊断以寻找组织碎片、细胞群、细胞团和单个细胞的形态结构及彼此关系为依据，对恶性肿瘤浆膜腔积液中癌细胞作出早期的诊断，为进一步治疗提供重要参考。但是针对某些形态结构极其相似的细胞如不典型增生细胞、组织修复细胞和某些良性改变细胞会造成假阳性诊断，还有不典型组织修复细胞，常常出现大核仁、多核仁，偶尔见到核分裂相，其与低分化癌或腺癌鉴别困难，往往误诊或不能确诊。此外，对于某些不明原因引起的胸腹腔积液也不能作出准确的判断[7-8]。

NIR荧光成像具有分辨率较高、实时动态、活体无创等优点，是最具临床转化潜力的光学成像技术，其近红外光谱范围为700～1 000 μm，穿透组织距离可高达数厘米，并且不受生物体自发荧光的干扰，进而提高了成像的灵敏度和准确性[9]。目前，NIR荧光成像研究的热点是分子探针的开发和制备，其中无机荧光分子如量子点（quantum dots，QDs）及有机荧光染料吲哚类菁染料如ICG、Cy3、Cy5应用最为广泛[10]。但是这些荧光材料本身不具有肿瘤靶向识别能力，需通过化学连接的方法结合某些具有肿瘤靶向识别作用的生物分子，如短肽、RNA或DNA、蛋白质和抗体等，制备多功能分子探针。潜在的化学合成作用可能会改变某些近红外染料或肿瘤配体的结构，影响其成像及靶向性能；此外，探针的表面修饰和制备费用昂贵，携带的重金属成分具有潜在毒性，因此筛选能直接靶向肿瘤细胞的小分子荧光化合物迫在眉睫[11]。

最近发现某些天然NIR荧光染料如IR-780，无需借助化学作用，能直接靶向肿瘤近红外成像。在细胞水平、肿瘤皮下瘤动物模型和肿瘤转基因动物模型等方面，这一特性均得到验证[12]。研究发现，与正常组织荧光信号比较，IR-780在肿瘤组织中的荧光信号强度可提高20倍，传统生物发光信号标准界定荧光信号比值达到2.5即具有肿瘤主动靶向作用，且在肿瘤组织中可稳定存在2周以上，因此此类染料具有较强的荧光信号强度，适合体内外长期示踪、重复成像[13]。此外，IR-780在体内代谢较为稳定，能通过循环系统代谢排出体外，生物相容性好，未见明显的毒副作用。但目前其作用机制还不是很清楚，此类染料属于亲脂性阳离子染料，而肿瘤细胞中线粒体具有较高的膜电位，染料会选择性地聚集在活的肿瘤细胞线粒体内，具体作用机制还需进一步探索[14-15]。

IR-808在IR-780化学结构的基础上进行了改进，增加了亲水性基团，无需有机溶剂助溶即可在水中溶解，且性能没有改变。我们将IR-808分别与正常细胞和肿瘤细胞共孵育，近红外荧光成像发现肿瘤细胞有强荧光信号，而正常细胞无明显信号；在正常小鼠、人乳腺癌动物模型体内也观察到IR-808靶向肿瘤近红外荧光成像的性能，染料尾静脉注射24 h后开始靶向肿瘤成像，且信号在24及48 h仍然很稳定；解剖发现仅肿瘤组织有信号，其他重要组织器官无信号，得到了较好的预期结果。基于上述研究成果，我们推测IR-808也能与胸水中癌细胞靶向结合，用灵敏性、特异性更高的近红外成像方法即可检出。我们收集临床上1例恶性胸水标本，孵育染料IR-808，发现其能检测到标本中的肿瘤细胞，并结合病理诊断验证其准确性。近红外花青染料IR-808有可能成为检测肿瘤发生的新指标，为恶性肿瘤患者胸水甚至其他体液中肿瘤细胞的诊断提供一种新方法。

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（收稿：2015-02-03修回：2015-05-12）

Preliminary research on tumor detection by new near-infrared fluorescence dye

TIAN Ying,LU Guang-ming,ZHENG Ling
（Department of Medical Imaging,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command,Nanjing 210002,China）

Objective To explore IR-808 near-infrared fluorescence dye for its in vivo and in vitro application to tumor detection and other clinical application.Methods Human malignant cell lines(colon cancer cell line HCT116,lung cancer cell line A549 and breast cancer cell line MCF-7)were incubated with IR-808 with a concentration of 20 μmol/L for 20 min,and human normal cells embryonic kidney cells(293T)were used as control.The subcutaneous tumor xenografts models were established by bearing human breast cancer cells,the imaging effect was observed 24 h after i.v injection of IR-808 at the dose of 1 mg/kg.One malignant pleuroperitoneal effusion sample was collected and incubated with IR-808 at the same concentration 24 and 48 h after,and then the stability of fluorescence signal and the tumor imaging effect were detected subsequently.Results The targeted imaging performance to cancer cells using IR-808 was confirmed in vitro and in vivo,and the fluorescence signal was very stable.Cancer cells in clinical effusion incubation with IR-808 were also detected.Conclusion IR-808 exhibits the property of tumor targeted imaging,which could be further used to detect tumor cells in clinical samples.So IR-808 will have great potential application in the future.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（10）：24-26，29]

near-infrared fluorescence dye IR-808;tumor;targeting imaging

[中国图书资料分类号]R318；R730.4A

1003-8868（2015）10-0024-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.10.024

田迎（1983—），女，技师，主要从事分子影像与分子病理学方面的研究工作，E-mail：ty52111@sina.com。

210002南京，南京军区南京总医院医学影像科（田迎，卢光明，郑玲）

郑玲，E-mail：cjr.zhengling@vip.163.com