离子排斥色谱法对发酵液中的L—赤藓酮糖及赤藓糖醇的测定

潘龙　祁静　靳魁奇　郑小娟　张磊　刘宇鹏

摘要：采用离子排斥色谱法对赤藓糖醇及发酵产物L-赤藓酮糖进行了分析。以高交联度磺化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物多孔微球作为固定相的Aminex HPX-87C离子色谱柱为分析柱，利用示差折光检测器分析了发酵液中赤藓糖醇和L-赤藓酮糖。通过色谱条件优化，选定了60 ℃柱温和30%（V/ V）乙腈作为流动相。发酵液样品中赤藓糖醇和L-赤藓酮糖的平均回收率在97.2%～101.8%，精密度偏差在0.9%～2.4%范围内。

关键词：L-赤藓酮糖；赤藓糖醇；示差折光检测器；离子排斥色谱法

中图分类号：O657.7+5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）22-5719-03

Abstract：A method using ion exclusion chromatography was described for the simultaneous determination of erythritol and its metabolites L-erythrulose as products of fermentation. Erythritol and L-erythrulose were analyzed by a sulfonated polystyrene divinylbenzene column （Aminex HPX-87C） with a refractive index detector. It was found that the optimal conditions for separation were 60 ℃ column temperature and 30%（V/V） acetonitrile as mobile phase，which applied to the quantification. The results showed that the recoveries were in the range of 97.2%～101.8% and the precision CV ranged from 0.9%to 2.4%.

Key words： L-erythrulose； erythritol； refractive index detector； ion-exclusion liquid chromatography

赤藓糖醇（Erythritol）[1]是一种具有清凉口感的填充型甜味剂，不仅拥有糖醇类产品的防止龋齿、适宜糖尿病患者等优点，其相对甜度0.65，有清凉感，发热量低，约为蔗糖发热量的1/10。赤藓糖醇溶于水（37%，25 ℃），溶解度低于蔗糖，易结晶，不易被酶降解，结肠中不发酵，只能透过肾排出，不参与糖代谢和血糖变化，宜于糖尿病患者食用。L-赤藓酮糖（L-erythrulose）[2]是一种天然四碳酮醣，呈黏稠液态，溶于水，其醛糖形式是L-赤藓糖。L-赤藓酮糖可与皮肤外部或者老死表层中的角蛋白氨基酸发生反应（表皮的角质层），在化妆品工业中作为二羟基丙酮的替代品，解决了多数人群对二羟基丙酮的过敏问题。目前，L-赤藓酮糖一般以赤藓糖醇（meso-erythritol）为原料化学合成[3]，但此法繁琐，且产物为消旋体手性化合物，拆分困难。微生物转化法[4]合成，可通过发酵过程中的酶促反应选择性生成L型产物，且该法操作简便，绿色环保。因此，以赤藓糖醇为底物，通过微生物发酵转化生产L-赤藓酮糖逐渐引起人们的关注。

测定发酵液中L-赤藓酮糖的方法包括HPLC法[5]、薄层色谱法[6]和容量分析法[7]，其中薄层色谱法只能定性分析，无法精确定量；容量分析法易受发酵液中的杂质干扰，无法精确测定；HPLC可直接进样，样品不需要复杂前处理，因此更快捷和准确。尽管国内已有HPLC法分析赤藓糖醇和L-赤藓酮糖的报道[5]，但一般采用氨基柱分析。

该试验选用了高交联度磺化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物多孔微球的minex HPX-87C离子色谱柱[8]，分析了发酵液中的赤藓糖醇和L-赤藓酮糖。该法集合离子排斥，离子交换、配位体交换等多种分离机制，提供了较好的分离能力，分离效率大为提高。该研究可为赤藓糖醇和L-赤藓酮糖的定量分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1515型高效液相色谱仪，配备2414型示差折光检测器，2489型紫外可见光检测器，2707型自动进样器（美国Waters），Breeze色譜工作站。

L-赤藓酮糖购于美国Sigma公司；赤藓糖醇购于山东三元生物科技有限公司。

乙腈、甲醇均为色谱纯试剂，蛋白胨和磷酸二氢钾均为分析纯，酵母粉为生化试剂，去离子水。

1.2 菌种

氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans 1.637）购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.3 方法

1.3.1 色谱分析 色谱柱BioRad公司Aminex HPX-87C柱，（300 mm×7.8 mm，9 μm）；柱温40～60 ℃；流动相：乙腈-水梯度洗脱，流速0.6 mL/min，进样量20 μL；折光检测器检测赤藓糖醇和L-赤藓酮糖；检测器温度50 ℃。

1.3.2 发酵条件 发酵培养基配方（质量百分数）为赤藓糖醇5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，无水磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.3%，pH 6.8；发酵条件：取对数期种子液，按5%接种量接入250 mL三角瓶，装液量30 mL，pH 6.8，30 ℃振荡（220 r/min）培养28 h。

1.3.3 样品处理 取10 mL发酵液，离心除去菌体和沉淀，然后将上清液稀释，再用0.45 μm的微孔滤膜过滤备用。

1.3.4 标准溶液的配制 称取一定量标准品，用去离子水配成标准溶液，所有标准品浓度均为1.0 g/L。

2 结果与分析

2.1 赤藓糖醇与L-赤藓酮糖分离条件的研究

预试验比较了C8和Aminex HPX-87C柱的分离效果，结果表明，Aminex HPX-87C分析发酵液中赤藓糖醇与L-赤藓酮糖，其目标物和杂质的分离度大于1，满足分析要求。

L-赤藓酮糖一般采用紫外检测器测定[9]，但培养基中的酵母粉、蛋白胨中的组分对于定量分析干扰较大，为此，试验选择了示差折光检测器分析发酵液中L-赤藓酮糖及糖醇。该检测器不仅可排除培养基中的成分干扰，并且能同时测定赤藓糖醇和代谢产物L-赤藓酮糖，其检测准确度优于紫外检测器。

据报道，AminexHPX-87C色谱柱分析发酵液中的各种糖类[10]。此色谱柱推荐使用流动相为去离子水。由于赤藓糖醇与L-赤藓酮糖的结构式相似，在色谱图中这两种物质未能完全分开，在流动相中加入乙腈后（最大含量30%），赤藓糖醇与L-赤藓酮糖的分离度大于1。

柱温和流动相中乙腈的浓度对离子色谱分离效果影响显著[11]。试验分析了流动相乙腈的浓度分别为10%、20%、30%，柱温分别为40、50和60 ℃等9个条件，结果见图1。

由图1可知，在较低温度和流动相浓度时，赤藓糖醇与L-赤藓酮糖的分离效果不佳。当升高柱温和增加流动相浓度时，赤藓糖醇与L-赤藓酮糖的分离较好，故选择柱温60 ℃，30%乙腈-水分析，该条件下的色谱图见图2。

2.2 外标工作曲线和线性范围的确定

将混合标准溶液在上述色谱条件下分析，以峰面积外标法定量，赤藓糖醇与L-赤藓酮糖的标准曲线方程和参数见表1，由表1可知，该方法的线性较好，满足分析需要。

2.3 样品分析

以50 g/L的赤藓糖醇为碳源，取发酵20 h的发酵液（稀释50倍）进行色谱分析，样品色谱图见图3。

结果表明，样品中的杂质对分离无干扰，氧化葡萄糖酸杆菌发酵液样品中的L-赤藓酮糖达34.40 g/L，赤藓糖醇达14.30 g/L。

经回收分析，赤蘚糖醇和L-赤藓酮的加标回收率大于97%（表2），满足分析要求。

3 小结

该法可同时定量分析发酵液中的L-赤藓酮糖和残余的底物赤藓糖醇，发酵液中其他组分对测定不干扰。本研究采用的色谱条件不需对发酵液进行处理，且能够把赤藓糖醇和L-赤藓酮糖完全分开，分辨率高，线性范围宽，能够实时提供发酵液中底物和产物含量变化的数据，结果可靠，该方法将为开发相关天然产物提供技术基础。

参考文献：

[1] 徐 莹，李景军，何国庆.赤藓糖醇研究进展及在食品中的应用[J]. 中国食品添加剂，2005，32（3）：92-95.

[2] IMFELD D，SCHMIDHALTER D，MARIE L.Process for the biotechnological preparation of L-erythrulose[P].世界专利，WO2001042483 A1，2001-06-14.

[3] 张永勤，薛长湖，汤浩源，等. 还原糖的可见分光光度法研究进展[J].食品与发酵工业，2007，33（5）：97-100.

[4] 魏 群.基础生物化学实验[M].第三版.北京：高等教育出版社，2009.

[5] 葛驰宇，张君丽，陈建华.高效液相色谱法同时测定发酵液中赤藓糖醇和L-赤藓酮糖的含量[J].色谱，2012，30（8）：843-846.

[6] 张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1999.

[7] 张永勤，王哲平，宋雨梅，等.还原糖测定方法的比较研究[J].食品工业科技，2010，31（6）：323-325.

[8] 刘宇鹏，郑 璞，孙志浩，等.采用离子排斥色谱法分析发酵液中的琥珀酸等代谢产物[J].食品与发酵工业，2006，32（12）：119-123.

[9] 袁 野，应向贤.高碘酸氧化法直接测定发酵液中赤藓糖醇[J].无锡轻工大学学报，2000，19（1）：72-75.

[10] CHINNICI F，SPINABELLI U，RIPONI C，et al.Optimization of the determination of organic acids and sugars in fruit juices by ion-exclusion liquid chromatography[J]. Journal of food composition and analysis，2005，18（2）：121-130.

[11] QIU J，JIN X.Development and optimization of organic acid analysis in tobacco with ion chromatography and suppressed conductivity detection[J]. Journal of Chromatography A，2002， 950（1）： 81-88.

（责任编辑 周有祥）