石仙桃总黄酮提取物对小鼠抗缺氧作用的研究

刘建新　李燕　凌红　郑礼肖　汤宣新

摘要：将小鼠分成试验组和对照组，试验组小鼠通过腹腔注射分别给予不同剂量（20、40 mg/kg）的石仙桃总黄酮提取物，对照组腹腔注射生理盐水（0.1 mL/10g），各组小鼠分别进行常压密闭缺氧试验、亚硝酸钠引起的缺氧试验和负重游泳试验。结果表明，与对照组相比，不同剂量的石仙桃总黄酮提取物均显著延长了试验小鼠的常压密闭缺氧存活时间、亚硝酸钠引起的缺氧存活时间和负重游泳存活时间（P<0.05）。说明石仙桃总黄酮提取物对小鼠有明显的抗疲劳、抗缺氧作用。

关键词：石仙桃；总黄酮提取物；抗疲劳；抗缺氧

中图分类号：S285.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）22-5668-03

Abstract：To study the fatigue-resisting and anoxia-resisting effect of the total flavones extracts from PhoIidota chinensis Iindl.，the mice were randomly individed to test group and control group，each group was injected total flavones extracts with different dots and normal saline and finally taken normobaric hypoxia test，NaNO2-induced hypoxia test and loading swimming test.The results showed that the survival time of the mice in test groups during all tests were all significantly prolonged（P<0.05）.It indicated that the total flavones from PhoIidota chinensis Iindl.had obvious anti-fatigue and and anti-hypoxia effects on mice.

Key words：PhoIidota chinensis Lind.；total flavones；anti-fatigue；anti-hypoxia

黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类多酚类化合物，具有良好的抗氧化活性、清除自由基及对心脑血管的保护等作用，并能提高机体抗疲劳和耐缺氧的能力。石仙桃系兰科石仙桃属植物石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.）的全草，俗称石上莲、石橄榄、石穿盘等。始载于《生草药性备要》。其性甘味凉，具有养阴、清热、利濕、消瘀的功效[1]。民间常用于清肺、化痰止咳和抗疲劳等作用。石仙桃属植物全球约30种，中国有14种，产于南方，尤以西南地区多见。据研究表明石仙桃主要化学成分为萜类、酚类、木脂素类、黄酮类，多糖等[2-5]。笔者前期研究发现石仙桃提取物具有抗缺氧及抗疲劳作用，本试验旨在研究其总黄酮化合物是否为石仙桃主要活性成分之一，并对其抗缺氧和抗运动性疲劳作用进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物：SPF级昆明种小鼠，体重（20+2） g，雌雄兼有，自由取食，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2013-0004。实验动物质量合格证：No.43004700005357。

石仙桃总黄酮提取物的制备：总黄酮测定采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH分光光度比色法[6]，精确称取芦丁对照品2.70 mg，用70%乙醇溶解，用10 mL容量瓶定容至刻度，配成0.27 mg/mL芦丁对照品溶液，分别取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL至10 mL具塞试管中，加水至5 mL，加5%亚硝酸钠0.6 mL，摇匀静置6 min，加10%硝酸铝0.6 mL，摇匀静置6 min，加4%氢氧化钠3.0 mL，摇匀，加水至刻度，摇匀静置15 min。另取一支10 mL具塞试管，不加对照品溶液，只加显色剂，按照上法制成空白对照液。采用紫外可见分光光度计在510 nm波长处测定其吸光度，绘制标准曲线。精确称取2.000 g石仙桃粗粉至500 mL微波提取罐中，在一定功率、一定时间、一定温度、一定液料比、一定浓度乙醇的条件下提取，减压抽滤，回收滤液至少量，用70%乙醇定容至50 mL，制成待测溶液。取待测溶液5 mL，加入15 mL 70%乙醇，摇匀。取稀释液2 mL，显色，制成10 mL显色液及空白对照液，在510 nm下测定其吸光度，按回归方程计算出样品溶液中的总黄酮含量（mg/mL），根据稀释倍数及样品质量计算出样品中总黄酮的含量（mg/g）。然后通过石仙桃总黄酮的微波辅助提取法正交试验设计，在最佳工艺条件即微波功率300 W、提取时间 30 min、提取温度60 ℃、料液比1∶20（g/mL）、80%乙醇条件下，测定其吸光度，计算得石仙桃提取物中总黄酮含量为31.41 mg/g。制备4 mg/mL石仙桃总黄酮提取物，供试验时使用。

1.2 仪器

WF-4000C型常压微波快速反应系统（上海屹尧分析仪器有限公司）；Lambda35型紫外可见分光光度计（美国铂金埃尔默公司）；DZF-6050型烘箱（上海一恒科技有限公司）；EYELAN-1001型旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）。

1.3 方法

1.3.1 石仙桃总黄酮提取物对小鼠常压耐缺氧的影响 将小鼠随机均分为3组，每组10只，分别腹腔注射给予不同剂量的石仙桃总黄酮提取物（20、40 mg/kg）和生理盐水（0.1 mL/10 g）。给药20 min后，将小鼠放置在密封的250 mL含钠石灰的广口瓶中（瓶内放钠石灰10 g，每瓶放小鼠1只），瓶口涂凡士林密闭。观察小鼠至最后一次呼吸为止，用秒表记录时间，即为小鼠的存活时间。

1.3.2 石仙桃总黄酮提取物对亚硝酸钠引起的小鼠缺氧的影响 将小鼠随机均分为3组，每组10只，分别腹腔注射给予不同剂量的石仙桃总黄酮提取物（20、40 mg/kg）和生理盐水（0.1 mL/10g）。给药40 min后，分别按200 mg/kg的剂量腹腔注射给予亚硝酸钠，观察小鼠至最后一次呼吸为止，用秒表记录时间，即为小鼠的存活时间。

1.3.2 石仙桃总黄酮提取物对小鼠负重游泳存活时间的影响 将小鼠随机均分为3组，每组10只，分别腹腔注射不同剂量的石仙桃总黄酮提取物（20、40 mg/kg）和生理盐水（0.1 mL/10g）。给药40 min后，在小鼠尾根部负其体重3%的铅丝，置于水温30 ℃、水深35 cm、直径40 cm、桶高为50 cm的水桶中，每只水桶放入1只小鼠。用秒表记录小鼠自游泳开始至力竭下沉且8 s不能浮出水面的时间作为其游泳至力竭的时间。

1.4 统计学分析

所有数据均以平均数±标准差表示，采用SPSS 11.50统计软件包进行数据分析。组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 石仙桃总黄酮提取物对小鼠常压耐缺氧的影响

由表1可见，石仙桃总黄酮提取物高、低剂量组小鼠常压耐缺氧时间均比生理盐水对照组长，且与生理盐水对照组相比差异均达显著水平（P<0.05）；石仙桃总黄酮提取物高、低剂量组间差异也达显著水平（P<0.05）。提示石仙桃总黄酮提取物呈剂量依赖性地提高了小鼠的耐缺氧能力。

2.2 石仙桃总黄酮提取物对亚硝酸钠引起的小鼠缺氧的影响

由表2可见，石仙桃总黄酮提取物高、低剂量组小鼠耐组织性缺氧生存时间均比生理盐水对照组延长，且与生理盐水对照组相比差异均达显著水平（P<0.05）；石仙桃总黄酮提取物高、低剂量组间差异也达显著水平（P<0.05）。表明石仙桃总黄酮提取物呈剂量依赖性地延长了亚硝酸钠所致组织性缺氧小鼠的存活时间。

2.3 石仙桃总黄酮提取物对小鼠负重游泳存活时间的影响

由表3可见，石仙桃总黄酮提取物高、低剂量组小鼠负重游泳存活时间均比生理盐水对照组延长，且與生理盐水对照组相比差异均达显著水平（P<0.05）；石仙桃总黄酮提取物高、低剂量组间差异也达显著水平（P<0.05）。表明石仙桃总黄酮提取物呈剂量依赖性地延长了小鼠负重游泳存活时间。

3 小结与讨论

在缺氧代偿期，由于酸性代谢产物如乳酸和二氧化碳的蓄积，反射性地引起呼吸加深加快，心跳加强加快，增加心搏出量以及血液重新分配，最大程度地保证心脏和大脑等重要器官的最高血氧饱和度及血液供应。到缺氧晚期，持续的严重缺氧造成供氧不足而发生不可逆的机能障碍和损伤，甚至发生组织坏死和机体死亡。本试验结果表明，石仙桃总黄酮提取物能明显延长小鼠缺氧条件下存活时间，增强小鼠的应激反应能力，对机体重要器官心、脑在缺氧条件下的损伤起到了一定的保护作用。亚硝酸钠对机体的缺氧损害机制主要是使血液中的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，从而造成血红蛋白失去运输氧的能力，引起组织缺氧性损害。通过这两种耐缺氧试验，显示石仙桃总黄酮提取物不仅能提高供氧不足环境下的小鼠的生存能力，也能提高组织性缺氧环境下的小鼠的存活能力，表明石仙桃总黄酮提取物可提高机体对不同条件下的缺氧适应能力和生存能力。石仙桃总黄酮提取物能明显延长小鼠游泳存活时间，提高有氧条件下的运动能力，增加心肌工作能力的储备，具有有效提高运动能力和抵抗疲劳的作用。

综上所述，中药石仙桃不仅含有丰富的黄酮组分，而且石仙桃的黄酮组分是其抗疲劳和耐缺氧的重要活性成分之一。药材标准含量测定项目应以功能主治一致的有效成分为测定指标，因此本研究可为该药材标准的制定提供依据，也为进一步开发该药材的应用提供了理论依据。

参考文献：

[1] 易绪斐，邢福武，陈红锋，等.我国石仙桃属植物的分布和开发利用[J].华南农业大学学报，2004，25（3）：94-97.

[2] 马雪梅，李满飞，张庆荣.云南石仙桃化学成分的研究[J].中草药，1995，26（2）：59-62.

[3] 马雪梅，章 萍，于苏萍，等.云南石仙桃及石斛总生物碱和多糖含量的分析[J].中草药，1997，28（9）：561-563.

[4] 毕志明，王峥涛，徐珞珊，等.云南石仙桃中酚类成分的研究[J].中国中药杂志，2004，29（1）：47-49.

[5] 沈维治，邹宇晓，林光月，等.玛咖抗疲劳作用及活性组分研究[J].食品与生物技术学报，2014，33（7）：721-725.

（责任编辑 曾德芳）