酶抑制速测仪检测桑叶农药残留的前处理方法优化

孙海燕，陈伟国，董久鸣，杨一平，张芬

（1.海宁市蚕桑技术服务站，浙江海宁 314400；2.浙江省农技推广中心，浙江杭州 310020）

酶抑制速测仪检测桑叶农药残留的前处理方法优化

孙海燕1，陈伟国1，董久鸣2，杨一平1，张芬1

（1.海宁市蚕桑技术服务站，浙江海宁 314400；2.浙江省农技推广中心，浙江杭州 310020）

酶抑制法速测是检测农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的简便、快捷方法。采用CL-BⅢ残留农药测定仪，考察不同桑叶样本对检测抑制率的影响。结果表明：桑叶样本碎小、浸提过程中振荡处理都会提高抑制率，造成检测结果的假阳性；嫩叶的抑制率明显低于成熟桑叶；强桑1号和农桑14号2个桑品种的抑制率接近。据此，提出了应用酶抑制速测仪的桑叶前处理方法，用该方法检测无毒桑叶建立校准曲线，导入CL-BⅢ残留农药测定仪标准对照库，便于用户检测桑叶时参照，提高检测结果的可靠性。

酶抑制法；农药残留；快速检测；桑叶；方法

利用酶抑制原理快速检测农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留在我国已经得到广泛应用，具有快速方便、前处理简单、成本较低等优点，可实现现场定性和半定量测定，适用于对农药残留进行粗筛。近年来，农残速测作为保障农产品质量安全的一项重要措施得到广泛重视，乡镇一级基本都已配备整套农残速测仪器，甚至有的村或合作社或生产基地都已开始应用。海宁作为蚕桑主产区，多年来受到粮食作物使用农药污染桑叶的困扰，迫切需要简便、有效的桑叶农残检测技术，为此，我们将全市统一使用的CL-BⅢ八通道残留农药测定仪用于检测桑叶农药残留，旨在为养蚕安全提供主动、快捷的预检预防技术。

由于酶抑制法对生化反应条件要求严格，在检测过程中会受到多种因素干扰，检测结果易出现假阳性等问题［1］。国家标准GB/T 5009.199—2003中特别说明：葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性［2］。经前期检测对比发现，CL-BⅢ残留农药测定仪按照常规方法检测无毒桑叶样本的抑制率偏高，表明桑叶样本及其前处理方法可能存在干扰检测结果的某些因素。为此开展了相关试验研究，探索适用于桑叶农药残留检测的样本前处理方法，提高检测结果的可靠性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

仪器：CL-BⅢ八通道残留农药测定仪（上海复博农业科技有限公司）；电子天平，精确度0.1 g；HY-4调速多用振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；可调移液枪，2～100 μl，50～5000 μl；其它玻璃仪器；CCM-200 PLUS叶绿素含量测量仪（美国OPTI-sciences）。

试剂：CL-BⅢ残留农药测定仪配套试剂：提取液，酶试剂，显色剂，底物，由上海复博农业科技有限公司提供。

检测材料：农桑14号桑叶，强桑1号桑叶。

1.2 检测方法

样品检测：按照CL-BⅢ八通道残留农药测定仪标准操作方法对不同试验样本进行检测，单因素对比处理重复不少于6次。具体步骤如下。

称取1 g桑叶样品，剪碎后放入提取瓶内，加入5 ml提取液，浸提15 min；从中抽取2.5 ml浸泡后的提取液，移至空试管内，分别加入100 μl酶试剂、100 μl显色剂，静置15 min后，再加入100 μl底物，迅速摇匀后倒入比色皿中，放入酶速测仪比色池进行检测。

结果判定：仪器检测结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。为了直观显示检测结果，CL-BⅢ残留农药测定仪软件把检测的抑制率≥50%时判定为不合格，表明样品中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。抑制率≤50%时判定为合格，样品为阴性结果。

1.3 处理设置

1.3.1 桑叶表面清洗处理对比

选取无损伤的成熟桑叶，沿主叶脉剪成两半，一半在清水中轻轻漂洗1 min后自然晾干，另一半不清洗。两种待测桑叶剪成1 cm左右的小方块，然后按标准操作方法同时检测，对比两者检测。

1.3.2 浸提过程振荡与否对比

同一片桑叶一分为二，剪成1 cm左右的小方块，加入提取液浸15 min；其中一种将提取瓶置于振荡仪上低速振荡3 min；另一种每隔5 min用手摇晃提取瓶10下，共3次，两者同时检测对比。

1.3.3 桑叶样本剪切大小对比

同一片桑叶一分为二，一半用剪刀剪成1 cm左右的小方块，另一半剪成整块，由于5 ml提取液不能完全浸没过大的叶块，两种处理均改为2 g桑叶样品加入10 ml提取液。整块桑叶操作方法为：剪成4 cm左右的长方条，称准2 g，先卷成1 cm直径的圆筒，弯成圆弧后放入得取瓶底部，加入提取液摇匀，检测方法相同，比较桑叶样本大小的抑制率差异。

1.3.4 不同叶位桑叶对比

选取无损伤的枝条中下部成熟桑叶和上部较嫩桑叶，选用叶绿素快速测定仪测叶绿素含量，然后按1.3.3方法测定酶抑制率，比较不同叶位桑叶的叶绿素含量及其对比色结果的影响。

1.3.5 不同桑品种的检测对比

在同一桑园中分别从农桑14号和强桑1号上采摘枝条中下部相同叶位的成熟桑叶，按1.3.3方法测定酶抑制率。

2 结果与分析

图1 桑叶表面清洗与不清洗对抑制率的影响Figure 1Effect on the inhibition rate of mulberry leaves cleaning

2.1 桑叶表面清洗对检测的影响

桑树生长环境、生长时间和降雨等不同，桑叶表面的尘土等附着物相差很大，可能对速测仪比色结果产生干扰。图1为同一片成熟桑叶剪成两半后一半清水漂洗1 min后自然晾干，另一半不清洗，按标准操作方法同时检测，两者的检测结果平均值和标准差都接近，表明农药残留速测仪对桑叶表面不必进行预先清洗。

2.2 浸提过程中振荡与否对比

从图2可见，待检桑叶加入提取液后用振荡仪的抑制率明显高于用手摇晃的数据，可能是浸提过程中持续振荡导致桑叶组织内物质进入提取液。

图2 桑叶浸提过程振荡与否对抑制率的影响Figure 2Effect on the inhibition rate of oscillation during the extraction process

2.3 桑叶大小对抑制率的影响

为保证待测桑叶完全浸入提取液中，一般要求将桑叶剪成1 cm左右的小方块，由于桑叶汁液丰富、叶绿素含量高，剪得越碎可能导致组织液渗出量越多，对比色法检测结果的影响更大。此外，农药残留速测仪通常把50%的抑制率设定为是否合格界线，从清洗、振荡等前期试验采用小块桑叶浸提的检测结果看，多数抑制率在50%以上，仪器自动判定检测结果为不合格。从图3可见，整叶的抑制率确实明显低于碎叶，说明可有效防止桑叶组织液的浸出，或者说有助于降低对检测的干扰。

图3 桑叶大小形状对抑制率的影响Figure 3Effect on the inhibition rate of mulberry leaves size and shape

2.4 桑叶叶位对抑制率的影响

从图4可以看出，成熟叶的抑制率高于嫩叶，成熟叶的叶绿素含量同样高于嫩叶，表明不同叶位桑叶的老嫩程度和叶绿素含量存在相关性，叶绿素含量的高低与检测抑制率呈正相关。

图4 桑叶叶位对抑制率的影响Figure 4Effect on the inhibition rate of mulberry leaves position

2.5 不同桑品种对抑制率的影响

图5可见，农桑14号和强桑1号成熟桑叶的抑制率数据比较接近，农桑14号略高于强桑1号，可能与农桑14号叶色深绿有一定关系。检测结果表明，农药残留速测仪对农桑14号和强桑1号空白桑叶的检测结果无明显差异。

图5 不同桑品种与抑制率的关系Figure 5Relationship between different mulberry varieties and inhibition rate

2.6 桑叶样品前处理方法与标准对照的建立

为了解决部分果蔬检测结果的假阳性问题，CLBⅢ残留农药测定仪电脑版专用软件建立了30种果蔬的标准对照库。通过CL-BⅢ残留农药测定仪对大量桑叶样品的检测，确定了桑叶样本采集和前处理方法，以此方法测定无毒桑叶，对检测数据进行处理后生成桑叶标准对照。用户需要使用CL-BⅢ残留农药测定仪检测桑叶样品的，可从上海复博农业科技有限公司网页下载桑叶标准对照。

3 小结与讨论

3.1 假阳性的消除

减少或消除酶抑制速测法中假阳性的影响，提高对样品中农药残留快速检测的准确性，报道了加热、调节酸碱度等不同的前处理方法［1，3-5］。但这些方法在检测桑叶样本时是否适用，或者说增加过多的前处理设备与快速检测方法不相吻合。本试验采用比较简单、可操作性较强的方法，有效降低了空白桑叶样品的抑制率，减少了产生假阳性的可能。

3.2 桑叶样本的采集

果蔬类样品通常在其成熟期或采摘期前进行检测，不同品种大致都有内在一致性。而桑叶作为检测对象时，生长期相差极大，小蚕吃的嫩叶生长还不到10 d，大蚕吃的成熟叶有可能超过50 d。对比结果表明，不同叶位桑叶的老嫩程度和叶绿素含量以及抑制率的高低都存在相关性，枝条顶部嫩叶的叶绿素含量低，检测的抑制率也低。相对来说，枝条中部成熟桑叶的生长期略长于大多数有机磷类与氨基甲酸酯类农药的残毒期，因此作为检测样本的代表性较强。

3.3 检测桑叶的前处理方法

当CL-BⅢ残留农药测定仪用于检测桑叶农残时，也要参考仪器检测的判定结果，通过对无毒桑叶不同处理方法检测对比表明：桑叶样本碎小、浸提过程中振荡处理的抑制率明显提高，仪器判定不合格，表现为检测结果的假阳性；而嫩叶的抑制率明显低于成熟桑叶，可能导致检测结果的假阴性。而这种偏离现象可以通过调整优化样品的前处理方法得以纠正。因此，根据试验结果确定了桑叶样品的前处理方法为：采摘枝条中部无损伤的成熟叶片，剪成大块整叶浸入提取液中15 min，期间每隔5 min用手摇晃提取瓶10下，共3次，后续检测按常规方法操作。

3.4 桑叶检测的标准对照库应用

基于上述桑叶样本选定和前处理方法测定的清洁桑叶抑制率数据建立校正曲线，导入到CL-BⅢ残留农药测定仪标准对照库，在检测桑叶样本时从标准对照库中选择桑叶，仪器检测过程中对照标准库校正后的结果输出抑制率数据。当然，如果桑叶样本和前处理不参照本方法的，也可进行检测，但是每次检测时必须要添加一个空白对照。

3.5 检测结果判定的参考指标

酶抑制快速检测原理是利用抑制率与农药残留正相关的关系，但不同农药达到相同抑制率的残留浓度差异较大［6］，因而提出抑制率在40%～70%时为农残可疑超标，应当重复检测。具体到仪器自动判定检测结果时，必须设置一个参考数值，CL-BⅢ残留农药测定仪把＜50%的抑制率作为鉴别合格的参照标准，能够适用于绝大多数的检测。

家蚕是一种对化学物质极为敏感的经济昆虫，常因农药污染导致重大经济损失［7］。将农残快速检测仪用于桑叶检测既扩展了适用范围，又为蚕桑生产安全提供了一种主动预防措施，但还需要不断完善。对于桑叶农残检测，关键是掌握实际残留量对家蚕的影响程度，建立检测抑制率与生物毒性的对应关系。

［1］桑园园，柴丽娜，魏朝俊，等.酶抑制法检测4种辛辣蔬菜农药残留假阳性消除的研究［J］.中国农学通报，2009，25（11）：60～64.

［2］GB/T 5009.199—2003，蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测［S］.

［3］郑金武，江晓燕.蔬菜农药残留快速检测中消除假阳性的检测方法［J］.安徽农学通报，2012，18（19）：189，192.

［4］葛静，王素利，钱传范，等.韭菜中农药残留酶速测法假阳性消除研究［J］.食品科学，2008，29（4）：299～301.

［5］王文，刘瑾，盛伟楠，等.采用酶抑制法检测大蒜中农药残留的改进方法［J］.食品科学，2013，34（12）：135～139.

［6］裘正军，陆江峰，何勇.基于酶抑制法的农产品农药残留快速检测系统及影响因素分析［J］.农业工程学报，2007，23（9）：229～233.

［7］鲁兴萌.养蚕中毒的原因分析和防范［J］.蚕桑通报，2008，39（1）：1～5.

Pre-treatment Methods Optimization of Enzyme Inhibition for Rapid Detection of Pesticide Residues in Mulberry Leaves

SUN Hai-yan1,CHEN Wei-guo1,DONG Jiu-ming2,YANG Yi-ping1,ZHANG Fen1
（1.Haining Sericulture Technology Service Station,Jiaxing 314400 Zhejiang,China; 2.Zhejiang Province Agricultural Technology Promotion Center,Hangzhou 310020,China）

Enzyme inhibition rapid detection is a simple and rapid method for the determination of residual organic phosphorus and amino acid ester pesticide residues in agricultural products.CL-BⅢpesticide residue detectors were used to detect the effects of different mulberry leaf samples on inhibition rate.The results showed that,small pieces of mulberry leaf samples and oscillating treatment in extraction process would increase inhibition rate,and false positive results were detected.The inhibition rate was significantly lower than that of mature leaves of mulberry leaves.The inhibition rate of the 2 mulberry varieties‘Qiangsang NO.1’and‘Nongsang NO.14’were close.Pre-treatment Methods optimization of enzyme inhibition for rapid detection were proposed.The calibration curve was established by detecting nontoxic mulberry leaves,and imported into the standard control library of CL-BⅢpesticide residue detector to facilitate detection of mulberry leaves and improve the reliability of test results.

enzyme inhibition;pesticide residue;rapid detection;mulberry;method

S882.2

A

0258-4069［2015］04-020-04

孙海燕（1980-），男，浙江海宁人，本科，农艺师。主要从事蚕桑技术的运用与推广。E-mail：sunhy123@hotmail.com