超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中罗匹尼罗浓度

王洪允，刘 明，胡 蓓，江 骥（中国医学科学院北京协和医院临床药理中心，北京 100730）

超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中罗匹尼罗浓度

王洪允，刘 明，胡 蓓，江 骥（中国医学科学院北京协和医院临床药理中心，北京 100730）

建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）测定人血浆中罗匹尼罗浓度的方法，采用向血浆样品中加入氘代内标后，以甲基叔丁基醚进行萃取。色谱柱为Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm× 50mm×1.7μm），流动相为甲醇-10mmol／L乙酸铵（含0.2%氨水）（80∶20，V／V），流速为0.4mL／min。采用多反应监测（MRM）扫描模式，以电喷雾离子源（ESI）正离子方式检测。结果显示，方法的线性范围为0.02～5μg／L，最低定量限为0.02μg／L，日内、日间精密度均小于15%，准确度在85%～115%之间，萃取回收率为85%。该方法快速、灵敏、专属性强，不受血浆基质的影响，不同条件下的稳定性考察结果良好，适用于罗匹尼罗的人体药代动力学研究。

超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）；罗匹尼罗；血药浓度；药代动力学

罗匹尼罗（ropinirole，商品名Requip）是第二代多巴胺受体激动剂，主要适应帕金森病和多动腿综合症［1-2］。该药物能够选择性地刺激多巴胺D2受体，增强多巴胺作用，矫正中枢神经传导素的不平衡，解除症状并维持病人的自主性与活动力。临床研究证明，罗匹尼罗不仅能够有效地缓解运动徐缓、僵直和震颤，还能明显地改善患者的日常生活能力及情绪，对帕金森病的各种阶段均有较好的疗效［3-5］，而且其副作用较少，常见的不良反应包括恶心、头痛和嗜睡等。在最新版的《帕金森病治疗指南》中，罗匹尼罗已经成为该类疾病治疗的初始一线药物。

罗匹尼罗血药浓度的测定方法主要有高效液相色谱（HPLC）法和高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS／MS）法［6-10］。近年来，超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）法在生物医学和药物研究领域的应用逐渐增多。与传统的分析方法相比，UPLC-MS／MS法能够获得更高的灵敏度和分析效率，特别适用于大批量生物样品的高通量分析。本研究采用UPLC技术进行色谱分离，以电喷雾离子源和多反应离子扫描进行检测，拟建立测定人血浆中罗匹尼罗药物浓度的UPLC-MS／MS方法，以适用于罗匹尼罗的人体药代动力学研究。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Xevo TQS三重四极杆串联质谱仪：美国Waters公司产品，配有电喷雾离子源（ESI）及MassLynx 4.0数据处理系统；Acquity超高效液相色谱仪：美国Waters公司产品；低温高速离心机和涡流混合器：德国Heraeus公司产品；DB-3D型氮气吹干仪：英国Techne公司产品；AX240十万分之一分析天平：瑞士Mettler Toledo公司产品；纯水机：美国Milli-Q公司产品；WinNonlin软件（Version 6.3）：美国Pharsight公司产品。

1.2 主要材料与试剂

罗匹尼罗对照品（批号5801-7，纯度99.6%）、内标［2H6］-SKF101468对照品（批号JW46955-097A1，纯度88.0%）、罗匹尼罗缓释片（2mg／片）：由葛兰素史克（中国）投资有限公司提供，其结构示于图1；甲醇（色谱纯）：Honeywell Burdick ＆Jackson公司产品；叔丁基甲醚（色谱纯）：美国Thermo-Fisher公司产品；纯水：由Milli-Q纯化系统制备；空白血浆：来自北京协和医院血库。

图1 罗匹尼罗（a）及其内标（b）的结构式Fig.1 Chemical structures of ropinirole（a）and its internal standard（b）

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×50mm×1.7μm）；流动相：甲醇-10 mmol／L乙酸铵（含0.2%氨水）（80∶20，V／V）；流速0.4mL／min；进样体积5μL。

1.3.2 质谱条件 电喷雾离子源；正离子电离；毛细管电压3.0kV；锥孔电压25V；锥孔气流速50L／h；离子源温度120℃；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气流速900L／h；碰撞气为氩气，碰撞能为26V；采用多反应监测（MRM）质谱扫描方式进行测定：罗匹尼罗m／z 261.2→114.2，［2H6］-罗匹尼罗（内标）m／z267.2→120.1。

1.4 血浆样品处理

取100μL血浆样品，加入20μL（10μg／L）内标工作液，涡旋振荡10s，然后加入300μL甲基叔丁基醚，再涡旋振荡30s。以3 000r／min离心5min后，取200μL上清液，转移至洁净试管中，于40℃下以氮气吹干，用200μL乙腈-水溶液（50∶50，V／V）复溶，取5μL进样测定。

1.5 方法学考核

参照美国食品药品监督管理局（FDA）在2013年颁布的指导原则［11］，对本方法的特异性，标准曲线线性，最低定量浓度，准确度和日内、日间精密度，萃取回收率，稀释实验以及稳定性（长期、室温、冻融和自动进样器放置）进行考核和基质效应考察。

2 结果与讨论

2.1 方法学考核

图2 空白血浆（a）、空白血浆中加入内标（b）、最低定量浓度（LLOQ）样品（c，0.02μg／L）、受试者服药后2h血浆样品（d）的典型质量色谱图Fig.2 Typical MRM chromatograms of blank plasma（a），blank plasma spiked with IS（b），LLOQ sample（c，0.02μg／L）and a subject plasma sample at 2hpost-dose（d）

2.1.1 特异性 分别取空白血浆、空白血浆加标样、受试者给药后收集的血浆样品，按1.3节和1.4节进行分析，其质量色谱图示于图2。结果表明，罗匹尼罗和内标的保留时间分别为0.60min和0.59min时，色谱峰峰形良好，血浆中内源性物质不干扰罗匹尼罗及其内标的测定。

2.1.2 标准曲线线性关系 按照上述方法制备并测定血浆标准曲线样品，标准曲线浓度点依次为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5μg／L。以罗匹尼罗浓度为纵坐标，药物与内标峰面积之比为横坐标，权重系数为1／X2，进行线性回归，得到回归方程y＝0.507 166x＋0.006 724 68，r＝0.998。

2.1.3 最低定量浓度（LLOQ） 以血浆标准曲线的最低非零浓度点作为本方法的最低定量浓度（即0.02μg／L），制备并测定6个LLOQ样品，连续测定3天。结果显示，LLOQ的准确度分别为105.0%，日内和日间精密度（RSD%）分别为8.5%和9.5%，结果列于表1。

表1 罗匹尼罗的测定准确度，日内、日间精密度和萃取回收率Table 1 Accuracy，intra-and inter-day precision and extraction recoveries of ropinirole

2.1.4 准确度和日内、日间精密度 按照上述方法制备并测定低、中、高3种浓度的质控样品（0.06，0.25和4μg／L），每一浓度制备并测定6次，连续测定3天，计算准确度和日内、日间精密度。结果显示，本方法的准确度在85%～115%之间，日内、日间精密度均在15%以内，完全符合CFDA的相关规定。

2.1.5 萃取回收率 萃取样品：取低、中、高浓度的质控样品（n＝6），按照上述方法制备并测定；未萃取样品：配制浓度分别为0.06、0.25和4μg／L标准品溶液（溶剂为50%乙腈-50%水，V／V），取空白血浆，按照1.4节方法处理至氮气吹干步骤，分别以上述3种浓度的溶液（体积200μL）进行复溶，并测定。将萃取样品与相同浓度未经萃取样品的峰面积比较，计算罗匹尼罗的萃取回收率。结果显示，低、中、高浓度样品的平均萃取回收率分别为85.4%，85.0% 和87.3%，符合CFDA的相关要求。

2.1.6 基质效应 配制浓度分别为0.06、0.25和4μg／L罗匹尼罗标准品溶液（溶剂为50%乙腈-50%水，V／V）。取6份来自不同个体的空白血浆，按照1.4节方法处理至氮气吹干步骤，分别以上述3种浓度溶液（体积200μL）进行复溶并测定（每一浓度制备并测定6次，共18次），与相同浓度的上述标准品溶液直接测定获得的峰面积比较，计算基质效应。结果显示，低、中、高浓度样品的平均基质效应因子分别为104.3%、94.4%和93.9%，RSD%分别为11.2%，9.2%和5.9%。这说明，在当前的分析条件下，不同来源的血浆基质对罗匹尼罗的测定没有影响。

2.1.7 稀释实验 配制25μg／L高浓度罗匹尼罗质控样品，以空白血浆稀释10倍后（n＝6），按照1.4节方法处理并测定。结果显示，稀释实验的准确度和精密度分别为101.3%和2.4%。因此，本方法的稀释因子可以设定为10。

2.1.8 稳定性考察 取低、中、高3种浓度的质控样品（n＝6）进行稳定性考察：长期稳定性，将样品在-30℃冻存7个月；室温稳定性，将样品在室温下放置24h；冻融稳定性，样品在-30℃和室温下反复冻、融3次，每次间隔12h；萃取后样品稳定性，将处理好的样品在室温下放置24h后测定，结果列于表2。结果表明：样品在-30℃可以稳定贮存3个月；室温下可以稳定放置24h；可耐受3次冻融循环；萃取后样品室温24h内稳定。此外，将在4℃条件下放置7个月的贮备液与新鲜配制的贮备液比较，证明贮备液在4℃条件下可以稳定放置7个月。

表2 罗匹尼罗的稳定性实验结果Table 2 Stability results of ropinirole

2.2 方法应用

24名中国健康受试者，年龄（31±3）岁，体重指数23.2±1.6，参加罗匹尼罗缓释片的药代动力学研究。受试者在试验前自愿签署知情同意书，体检、血常规、尿常规及血生化、血压、心电图、胸片检查均正常，HIV阴性，无药物过敏史和依赖史，不嗜烟、酒。试验前2周及试验期间未服用过其他任何药物。整个临床试验持续14天，受试者在第1天、第8～14天接受罗匹尼罗缓释片2mg／天，给药间隔为24h；第2～7天为单剂量和多剂量研究之间的洗脱期，不给药。采集下列时间点的系列血样：第1天，首次给药前（0h）和给药后1、2、3、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22、24、36、48、72、96、120、144、168h血样；第9～13天，给药前0h；第14天，给药前0h和给药后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h血样。24名受试者系列血样的平均血药浓度-时间曲线示于图3。结果表明，本方法可用于罗匹尼罗在中国健康受试者中的药代动力学研究。

2.3 讨论

图3 中国健康受试者单次和多次口服罗匹尼罗缓释片（2mg／天）后，罗匹尼罗的平均血药浓度-时间曲线（n＝24）Fig.3 Mean plasma concentration-time curves of ropinirole in Chinese healthy subjects following a single or multiple doses of ropinirole prolonged release tablets（2mg per day）（n＝24）

在方法开发过程中，鉴于该药物是弱碱性化合物，具有一定极性，容易形成［M＋H］＋准分子离子，因此采用ESI离子源在正离子模式下进行测定。为了提高分析效率，采用了先进的超高效液相色谱技术，罗匹尼罗及其内标均有较好的保留且峰形良好，每个样品的检测仅需1min，大幅提高了研究效率，实现了UPLCMS／MS的高通量分析。在样品制备方面，曾使用乙醚、二氯甲烷和甲基叔丁基醚进行液液萃取。结果发现，虽然这3种有机试剂都能将罗匹尼罗从血浆中萃取出来，但在本实验条件下，甲基叔丁基醚的萃取率最高，且干扰最少，因此采用甲基叔丁基醚作为萃取剂。此外，分析过程中，氘代同位素内标的使用也提高了分析方法的准确性和适用性。

3 结论

本研究建立了测定血浆中罗匹尼罗浓度的UPLC-MS／MS方法，并进行了严格的方法学考核。与传统的分析方法相比，该方法高效、灵敏、专属性强，测定时间仅需1 min，实现了UPLC-MS／MS技术的高通量分析，可为罗匹尼罗的人体药代动力学和药物代谢研究提供稳定、可靠的检测手段。

致谢：本研究的申办者是葛兰素史克（中国）投资有限公司。感谢参加本研究的医生、护士和实验室分析人员，特别感谢参加临床试验的受试者。

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Determination of Ropinirole in Human Plasma by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Hong-yun，LIU Ming，HU Pei，JIANG Ji
（Clinical Pharmacology Research Center，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Science，Beijing100730，China）

A method of ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）was developed for the determination of ropinirole in human plasma.The plasma samples were extracted with methyl tert-butyl ether after the addition of deuterated internal standard.The analytical column was Acuity UPLC BEH C18column（2.1mm×50mm×1.7μm），and the mobile phase was composed of methanol-10mmol／L ammonium formate in 0.2%ammonium solution（80∶20，V／V）.The flow rate was 0.4mL／min.Detection was performed with multiple reactions monitoring （MRM）using positive electrospray ionization（ESI）.The results show that the calibration curve is linear over the concentration range of 0.02-5μg／L.The lower limit of quantification is 0.02μg／L.Inter-day and intra-day precision are less than 15%，and the accuracy is within 85%-115%.Extraction recoveries are around 85%and the determination is independent of plasma matrix.In addition，the analyte is proved to be stable under various storage and processing conditions.Therefore，this method proves to be rapid，sensitive and specific，and suitable for the pharmacokinetic study of ropinirole in humans.

ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS／MS）；ropinirole；plasma concentration；pharmacokinetics

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0296-06

10.7538／zpxb.youxian.2015.0014

2014-07-21；

修回日期：2014-09-15

国家科技重大专项课题“重大新药创制”（2008ZX09312-016）资助

王洪允（1975—），男（满族），辽宁抚顺人，副研究员，从事药代动力学和药物代谢研究。E-mail：wanghongyunpharm＠yahoo.com

江 骥（1954—），男（汉族），江苏淮阴人，研究员，从事药代动力学和药物代谢研究。E-mail：pk.frosh＠gmail.com

时间：2015-01-30；

网络出版地址：http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150130.1601.014.html