HPLC-Q-TOF MS鉴定条叶榕根茎乙酸乙酯提取物中的主要化学成分

张小平，蒋可志，吕惠卿，聂 晶，李祖光（.浙江工业大学化学工程学院，浙江杭州 004；.杭州师范大学有机硅重点实验室，浙江杭州 ；.浙江中医药大学药物科学院，浙江杭州 005）

HPLC-Q-TOF MS鉴定条叶榕根茎乙酸乙酯提取物中的主要化学成分

张小平1，蒋可志2，吕惠卿3，聂 晶1，李祖光1
（1.浙江工业大学化学工程学院，浙江杭州 310014；
2.杭州师范大学有机硅重点实验室，浙江杭州 311121；
3.浙江中医药大学药物科学院，浙江杭州 310053）

采用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF MS）技术对条叶榕根茎乙酸乙酯提取物中的多种活性化学组分进行了分析鉴定。采用正离子与负离子两种扫描方式，依据高分辨质谱提供的准分子离子峰和碎片离子的精确分子质量信息，确证了有关物质及其特征碎片离子的分子组成。再结合标准品对照与相关文献数据支持，最终鉴定出条叶榕根茎乙酸乙酯提取物中的34种化学成分，其中包括12种多酚、8种香豆素、9种黄酮、4种脂肪酸、1种蒽醌。结果表明，采用HPLC-Q-TOF MS技术可提高中药化学成分的分析效率，有利于新化合物的发现与鉴别。

高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF MS）；条叶榕；化学组分；碎片离子

条叶榕（Ficus pandurata Hance）为桑科（Moraceae）榕属（Ficus）植物，别名小香勾、小叶牛奶绳，细叶牛乳绳等，是浙江丽水畲族广泛食用的一种食药兼用植物。现代药理研究表明，条叶榕具有健脾、利湿、抗氧化、抗炎等药理作用［1-4］，由于对条叶榕的药用有效成分的研究鲜有报道，阻碍了对其药理作用与临床应用的深入研究。近年来，将液相色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度相结合，尤其是与高分辨质谱和多级质谱联合使用的技术手段，已广泛应用于药用植物成分的分析，为研究天然产物开辟了全新的途径［5-17］。

基于条叶榕的药用价值，本实验采用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（HPLC-QTOF MS）技术对条叶榕根茎的乙酸乙酯提取物中的未知组分进行在线分离分析研究，根据其准分子离子以及特征碎片离子的精确质荷比，结合标准品、文献数据等鉴定条叶榕根茎乙酸乙酯提取物中的化学成分，并对它们的质谱碎裂模式与规律进行总结，以期为条叶榕植物中功能性活性成分的鉴定和研究提供科学依据，并为研究类似化学成分的质谱裂解途径提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Ultimate 3000高效液相色谱仪：美国Thermo Fisher公司产品，配有双元泵，真空脱气机，DAD检测器，以及变色龙色谱工作站；高分辨四极杆飞行时间质谱仪：美国Bruker公司产品；实验数据采用Data Analysis 4.0数据处理软件进行处理。

1.2 主要材料与试剂

甲醇（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司产品；实验用水：Milli-Q超纯水，并经0.22μm滤膜过滤；条叶榕药材：由浙江中医药大学提供，并经陈孔龙教授鉴定为桑科条叶榕（Ficus pandurata Hance）的干燥根茎。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Dionex C18柱（250mm×4.6mm×5μm）；二元梯度洗脱；流动相：A为水（含0.1%甲酸），B为甲醇；梯度洗脱条件：0～10 min、25%～40%B，10～40 min、40%～70%B，40～65 min、70%～95%B；进样体积10μL；柱温25℃；DAD检测器检测波长254nm；流速0.8mL／min；样品从高效液相色谱仪通过T型三通阀引入质谱离子源，分流比2∶1。

1.3.2 质谱条件 电喷雾（ESI）电离源，采用正离子与负离子两种扫描方式，以2mmol／L甲酸钠溶液为外标分别进行准确质量数校正。仪器的操作参数为：干燥气（N2）流速为8mL／min，雾化气（N2）压力为241kPa，毛细管温度为350℃，毛细管电压为3 500V，注射泵流速为5μL／min，质量扫描范围m／z 100～800，在m／z922.009 8处一级质谱分辨率大于20 000。二级质谱实验中，碰撞气为氩气，碰撞能量10eV，碰撞时间30ms，离子选择窗口为1u，使用自动采集模式自动选择一级质谱产生的最强离子峰作为二级质谱的母离子进行碎裂。

1.4 样品前处理

称取10.0g条叶榕根茎药材，粉碎后，按料液比1∶10用乙酸乙酯超声连续萃取3次，以提高萃取效率。萃取条件为：温度30℃，时间45min，超声功率100 W。将3次提取液合并离心后，取上清液，真空浓缩冷冻干燥成浸膏。称取0.1mg浸膏，用甲醇定容至10mL，超声处理，静置至室温，过0.22μm微孔滤膜，待分析。

2 结果与讨论

2.1 条叶榕根茎乙酸乙酯提取物的HPLC-QTOF MS分析

条叶榕根茎的乙酸乙酯提取物按照1.3节条件分析，获得了良好的分离效果及离子化效率，结果示于图1。结合ESI正负离子模式下检测所得的精确分子质量，应用Anaylst工作站给出的高分辨数据，可计算获得可能的元素组成（误差小于±5×10-6），确定可能的分子式。各成分经二级质谱分析，得到了特征碎片离子及准确的化学元素组成。结合标准物质，以及榕属植物化学成分文献研究，共鉴定了包括黄酮、香豆素、多酚、酸等共34种成分，详情列于表1，其结构示于图2。其中，通过对照品比对鉴定的化学成分有：原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、香草酸、咖啡酸、7-羟基香豆素、补骨脂素、佛手柑内酯、木犀草素、芹黄素、大黄素。

2.2 结构鉴定

2.2.1 酚酸类 酚酸类成分极性较强，在色谱柱上保留时间较短，出峰比较靠前。结合文献中的质谱数据与标准品对照等手段，在条叶榕根茎乙酸乙酯萃取物中共鉴定了16个酚酸类成分。以组分7为例，它经过电喷雾电离产生质子化离子［7＋H］＋（m／z169.049 0，C8H9O4＋），其二级质谱图示于图3。［7＋H］＋经碰撞诱导解离，分别丢失H2O（18u）和CO2（44u），产生碎片离子m／z 151.039 5（32%）和m／z 125.060 3 （44%）。m／z125.060 3离子继续碎裂，分别丢失CH3（15u）和CH3OH（32u）形成碎片离子m／z110.036 1（20%）和m／z93.034 1（100%），这与质子化香草酸标准品的碎片离子一致，结合文献［5］报道，可将化合物7鉴定为香草酸，其可能的碎裂途径示于图4。

图1 条叶榕根茎乙酸乙酯提取物的总离子流图Fig.1 TIC of ethyl acetate extract of Ficus pandurata Hance aerial roots

表1 HOLC-Q-TOF MS 技术鉴定的条形榕根茎乙酸乙酯提取物中的主要化学成分Table 1 IdentifIcation of the major chemical compounds detected in the ethyl acetate extract form ficus pandurata Hance acrial roots by HPLC-Q-TOF MS

续表1

续表1

图2 HPLC-Q-TOF MS技术鉴定条叶榕根茎乙酸乙酯提取物中34种组分的结构Fig.2 Possible chemical structures of compounds 1-34identified in the ethyl acetate extract of Ficus pandurata Hance aerial roots by HPLC-Q-TOF MS

图3 正离子模式下，化合物7的二级质谱图Fig.3 MS2 spectrum of compound 7under positive ion mode

图4 正离子模式下，化合物7的碎裂途径Fig.4 Fragmentation pathways of compound 7under positive ion mode

2.2.2 香豆素类 香豆素类化合物较易丢失质量为28的羰基，内酯结构又使其较易丢失CO2分子。根据这一规律共鉴定了8个香豆素组分，分别为：七叶亭、7-羟基香豆素、补骨脂素、佛手柑内酯、6-甲氧基-7-羟基-8-异戊烯基香豆素、欧芹酚、7-甲氧基-6-羟基-8-异戊烯基香豆素、别欧前胡素。以表1中化合物28为例，它经电离产生的质子化和去质子分子离子峰分别为m／z231.101 7（C14H15O3＋）和m／z229.087 0 （C14H13O3-）。经碰撞活化，［28＋H］＋丢失C4H8（56u）产生m／z175.039 0（64%）的碎片离子，然后继续丢失CO2（44u）形成碎片离子m／z131.000 9（7%），这与文献［11］报道的数据一致，因此推测化合物28为欧芹酚，其碎裂途径示于图5。化合物27与29分别产生质子化离子m／z 261.112 9（C15H17O4＋）和m／z 261.112 3（C15H17O4＋），根据表1的数据可知它们互为同分异构体，且分子质量比化合物28多30u（CH2O）。此外，它们经过碰撞诱导解离也均丢失H2O（18u）和C4H8（56u）形成m／z243和m／z205碎片离子，因此推测化合物27与29的结构比化合物28多了一个甲氧基取代。根据文献［11］报道的数据，可将化合物27与29暂定为6-甲氧基-7-羟基-8-异戊烯基香豆素和7-甲氧基-6-羟基-8-异戊烯基香豆素。

图5 正离子模式下，化合物28的碎裂机理Fig.5 Fragmentation pathways of compound 28under positive ion mode

2.2.3 黄酮类 黄酮类化合物特殊的母核结构使其骨架在ESI中具有丢失CO及CO2中性碎片特征以及逆Diels-Alder裂解的特征，这为黄酮类化合物的质谱解析及结构鉴定提供了依据。在负离子模式下，黄酮糖苷易丢失糖残基形成相应的基峰苷元碎片。根据黄酮类化合物的裂解规律，结合文献［19-20］已从榕属植物分离得到的化合物，共鉴定了9个黄酮类组分，列于表1。

以表1中化合物31（C20H18O5），32（C20H18O6）和33（C20H18O5）为例，讨论此类化合物的碎裂机理。它们的去质子化准分子离子峰分别为m／z337.106 9、353.101 8、337.108 1。通过二级质谱碰撞活化均产生丢失C4H8（56u）的碎片离子m／z281.046 6（100%）、298.046 7（100%）、281.046 7（45%）。其中化合物31和33的二级碎片中均含有m／z 117.033 5的离子，其质谱图示于图6，这与去质子化芹黄素标准品的特征碎片离子相同，可推测这2个化合物都与芹黄素具有相似的结构组成。再结合它们的相对分子质量信息，得出这2个化合物可能比芹黄素多1个异戊烯基，且该基团的连接位点在A环，因此它们为含有异戊烯基取代的芹黄素衍生物。同理，化合物32的碎片离子m／z 133.027 5（55%）与去质子化木犀草素标准品经过逆DA形成的特征碎片离子一致，因此推测它为含异戊烯基的木犀草素衍生物。结合文

献［19-20］报道以及相应的光谱数据，可将化合物31、32、33暂时鉴定为6-C-异戊烯基芹黄素，异戊烯基木犀草素，8-C-异戊烯基芹黄素或8-C-异戊烯基芹黄素，异戊烯基木犀草素，6-C-异戊烯基芹黄素。其中，化合物33可能的碎裂途径示于图7。

图6 负离子模式下，化合物33的二级质谱图Fig.6 MS2 spectrum of compound 33under positive ion mode

图7 负离子模式下，化合物33的碎裂机理Fig.7 Fragmentation pathway of compound 33under negative ion mode

3 结论

采用HPLC-Q-TOF MS技术对条叶榕根茎乙酸乙酯提取物的化学成分进行了研究，通过高分辨质谱中精确分子质量信息归属出元素组成以及裂解的碎片数据，然后结合标准品及相关文献共分析鉴定出34种组分，主要包括酚酸类、香豆素类、黄酮类等。其中，三羟基二苯乙烯己糖、四羟基二苯乙烯己糖苷、壬二酸、圣草酚、三羟基十八碳二烯酸、6-甲氧基-7-羟基-8-异戊烯基香豆素、欧芹酚、7-甲氧基-6-羟基-8-异戊烯基香豆素、别欧前胡素、6-C-异戊烯基芹黄素、异戊烯基木犀草素、8-C-异戊烯基芹黄素等在该植物成分分析中为首次报道。与低分辨质谱相比，HPLC-Q-TOF MS技术可提供子离子的元素组成等结构信息，提高了结构解析的准确性及分析效率，这为条叶榕中活性组分的鉴定和研究提供了理论依据。但多级质谱技术在结构鉴定方面依然存在一定的局限性，例如，对取代基取代不同位点的同分异构体的确认，裂解碎片的合理解释等相关文献较少。因此，采用多级质谱数据进行结构确认的工作需要进一步研究，通过总结不同类型化合物的质谱碎裂模式与规律，为中药化学成分及其类似物质的结构解析提供参考。

［1］ 应跃跃，王喜周，何国庆.条叶榕营养成分分析及黄酮含量的测定［J］.食品工业科技，2012，33 （14）：90-92.

YING Yueyue，WANG Xizhou，HE Guoqing.Analysis of the netritional components and content determination of total flavonoids in Ficus pandurata Hance var.angustifolia Cheng［J］.Science and Technology of Food Industry，2012，33（14）：90-92（in Chinese）.

［2］ 叶一萍，王法明，李慧珍.畲药小香勾合刺络拔罐治疗急性痛风性关节炎疗效观察［J］.浙江中医杂志，2013，48（2）：108-109.

YE Yiping，WANG Faming，LI Huizhen.Xiaoxianggou（She medicine）plus cupping therapy in the treatment of acute gouty arthritis［J］.Zhejiang Journal of Traditional Chinese，2013，48 （2）：108-109（in Chinese）.

［3］ 陈学智，谢志军，温成平，等.中心组合设计优化小香勾总黄酮提取工艺研究［J］.中华中医药杂志，2013，28（4）：1 122-1 124.

CHEN Xuezhi，XIE Zhijun，WEN Chengping，et al.Optimization of extraction of xiaoxianggou total flavonoids by box-benhnken design［J］.China Journal of Traditional Chinese，2013，28（4）：1 122-1 124（in Chinese）.

［4］ LV H，ZHANG X，CHEN X，et al.Phytochemical compositions and antioxidant and anti-Inflammatory activities of crude extracts from Ficus pandurata H.（Moraceae）［J／OL］.Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，2013，http：∥dx.doi.org／10.1155／2013／215036.

［5］ LIU M H，TONG X，WANG J X，et al.Rapid separation and identification of multiple constituents in traditional chinese medicine formula shenqi fuzheng injection by ultra-fast liquid chromatography combined with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2013，74：141-155.

［6］ VALLVERDU＇-QUERALT A，de ALVARENGA J F，ESTRUCH R，et al.Bioactive compounds present in the mediterranean Sofrito［J］.Food Chemistry，2013，141（4）：3 365-3 372.

［7］ FENG F，ZOU L，LI X，et al.An effective integrated method for comprehensive identification of eighty-five compounds in Zhi-Zi-Da-Huang decoction by HPLC-DAD-ESI-MS（TOF）and HPLCDAD-ESI-MS／MS（QqQ）without the help of reference standards［J］.Analytical Methods，2014，doi：10.1039／C4AY00219A.

［8］ ZHU Z，ZHANG H，ZHAO L，et al.Rapid separation and identification of phenolic and diterpenoid constituents from Radix Salvia Miltiorrhizae by high-performance liquid chromatography diode-array detection，electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry and electrospray ionization quadrupole ion trap mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2007，21（12）：1 855-1 865.

［9］ WANG H，SONG L，FENG S，et al.Characterization of proanthocyanidins in stems of Polygonum MultiflorumThunb as strong starch hydrolase inhibitors［J］.Molecules，2013，18（2）：2 255-2 265.

［10］朱培曦，蒋可志，郑金琪，等.液质联用法快速鉴定头孢丙烯7-APRA的Z／E异构体［J］.质谱学报，2014，35（3）：262-268.

ZHU Peixi，JIANG Kezhi，ZHENG Jinqi，et al.Rapid identification of cefprozil and 7-APRAZ／E isomers by HPLC-MS／MS［J］.Journal of Chinese Mass Spectrometry Society，2014，35（3）：262-268（in Chinese）.

［11］XIE Y，ZHAO W，ZHOU T，et al.An efficient strategy based on MAE，HPLC-DAD-ESI-MS／MS and 2D-Prep-HPLC-DAD for the rapid extraction，separation，identification and purification of five active coumarin components from radix angelicae dahuricae［J］.Phytochemical Analysis，2010，21（5）：473-482.

［12］叶晓珂，秦沛，李伟，等.液相色谱-串联质谱分离鉴定树莓叶中黄酮类化合物［J］.质谱学报，2011，32（5）：271-277.

YE Xiaoke，QIN Pei，LI Wei，et al.Separation and identification of flavonids of leaves of Rubus idaeus by high performance liquid chromatography electrospray ionization multi-stage tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chinese Mass Spectrometry Society，2011，32（5）：271-277（in Chinese）.

［13］尤珠双，徐晓燕，郭成，等.液质联用技术快速识别喜树叶提取物中的微量活性成分［J］.云南民族大学学报，2011，20（5）：340-347.

YOU Zhushuang，XU Xiaoyan，GUO Cheng，et al.Rapid identification of minor active constituents of leaves of Camptothecaby HPLC／ESI-MSn［J］.Journal of Yunnan University of Nationalities，2011，20（5）：340-347（in Chinese）.

［14］KANG J，ZHOU L，SUN J，et al.Chromatographic fingerprint analysis and characterization of furocoumarins in the roots of AngelicaDahuricaby HPLC／DAD／ESI-MSntechnique［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2008，47（4／5）：778-785.

［15］孙翠荣，陈娟娟，潘远江.高效液相色谱／质谱联用技术在天然来源生物活性成分快速识别中的应用［J］.中国科学：化学，2010，40（6）：621-630.

SUN Cuirong，CHEN Juanjuan，PAN Yuanjiang.Application of high performance liquid chromatography／mass spectrometry to rapid recognition of naturally occurring biologically active components［J］.Scientia Sinaica Chimica，2010，40（6）：621-630（in Chinese）.

［16］董静，王弘，万乐人，等.高效液相色谱／电喷雾-离子阱-飞行时间质谱分析鉴定中药虎杖中的主要化学成分［J］.色谱，2009，27（4）：425-430.

DONG Jing，WANG Hong，WAN Leren，et al.Identification and determination of major constituents in Polygonum Cuspidatum Sieb.et Zucc by high performance liquid chromatography／electrospray ionization-ion trap-time-of-flight mass spectrometry［J］.Chinese Journal of Chromatography，2009，27（4）：425-430（in Chinese）.

［17］郭迎迎，吴巍，秦秋杰，等.人参皂苷Rd酸水解产物的RRLC-Q-TOF MS研究［J］.质谱学报，2014，35（1）：79-840.

GUO Yingying，WU Wei，QIN Qiujie，et al.Study on the hydrolysis of Ginsenoside Rdby RRLC-Q-TOF MS［J］.Journal of Chinese Mass Spectrometry Society，2014，35（1）：79-840（in Chinese）.

［18］FIORENTINO A，D′ABROSCA B，DELLAGRECA M，et al.Chemical characterization of new oxylipins fromCestrum Parqui，and their effects on seed germination and early seedling growth［J］.Chemistry ＆Biodiversity，2008，5（9）：1 780-1 791.

［19］ZHANG Y，ZHANG P，CHENG Y.Structural characterization of isoprenylated flavonoids from kushen by electrospray ionization multistage tandem mass spectrometry［J］.Journal of Mass Spectrometry，2008，43（10）：1 421-1 431.

［20］BEULA S J，RAJ V B A，MATHEW B.Isolation and molecular recognization of 6-prenyl apigenin towards MAO-A as the active principle of seeds of Achyranthes aspera［J／OL］.Biomedicine ＆Preventive Nutrition，2014，http：∥dx.doi.org／10.1016／j.bionut.2014.03.003.

Identification and Characterization of Major Chemical Compounds in the Ethyl Acetate Extract fromFicus pandurata Hance Aerial Roots by HPLC-Q-TOF MS

ZHANG Xiao-ping1，JIANG Ke-zhi2，LV Hui-qing3，NIE Jing1，LI Zu-guang1
（1.College of Chemical Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou310014，China；
2.Key Laboratory of Organosilicon Chemistry and Material Technology，Hangzhou Normal University，Hangzhou311121，China；
3.College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou310053，China）

The major chemical compounds in the ethyl acetate extract fromFicus pandurata Hance aerial roots were analyzed using high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry（HPLC-Q-TOF MS）.The ESI-MS analysis was operated at the mass range of m／z100-800under both the positive and the negative ionization modes，respectively.A total of 34compounds，such as 12 phenolics，8coumarins，9flavonoids，4fatty acids，and 1anthraquinone，which are characterized in the ethyl acetate extract，based on the accurate mass of molecular and product ions provided by Q-TOF MS，comparison with standard substances and references.It is an effective method to provide chemical information concerning the constituents in herbal medicines，which makes component analysis more convinced.

high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-offlight mass spectrometry（HPLC-Q-TOF MS）；Ficus pandurata Hance；chemical compounds；fragment ions

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0310-11

10.7538／zpxb.youxian.2015.0018

2014-08-10；

修回日期：2014-11-05

浙江省中青年学科带头人学术攀登项目（Pd2013016）；国家自然科学基金项目（21205025）；浙江省科技厅项目（2015C32006）；2014年杭州市钱江特聘专家和农业部农药残留检测重点实验室项目资助

张小平（1989—），女（汉族），湖南耒阳人，博士研究生，质谱分析专业。E-mail：zhangxpsunshine＠163.com

李祖光（1971—），男（汉族），江西上饶人，博士生导师，从事分析化学的教学与科研工作。E-mail：lzg＠zjut.edu.cn蒋可志（1980—），男（汉族），浙江永嘉人，副研究员，硕士生导师，从事色谱和质谱检测与科研工作。E-mail：jiangkezhi＠hznu.edu.cn

时间：2015-05-26

；

http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150526.0919.008.html