非小细胞肺癌患者中循环肿瘤细胞的预测作用

王汉萍 张力

中国医学科学院北京协和医院呼吸内科，北京100730

非小细胞肺癌患者中循环肿瘤细胞的预测作用

王汉萍 张力#

中国医学科学院北京协和医院呼吸内科，北京100730

恶性肿瘤患者的血液中可检测到循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）。转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌中外周血CTC与疾病的复发及治疗反应的临床相关性已经被确立。研究晚期肺癌患者中CTC与临床的相关性对指导临床治疗的非常重要。CTC可能成为临床上提示肺癌预后；预测疾病进展；指导治疗的重要因素，将CTC检测转化到临床实践中并进一步改善标准化的CTC检测技术有重要意义。

循环肿瘤细胞；非小细胞肺癌；诊断；预测疗效

CTC是从肿瘤的原发灶或转移灶脱落下来进入外周血液循环中的肿瘤细胞。在恶性肿瘤的病程中，上皮组织来源的实体肿瘤可以各种不同的状态存在于人体中，包括初始时的惰性状态、较强侵袭性的状态，以及肿瘤从局部迅速播散到血液或淋巴循环中的强侵袭状态等[1]。CTC最早发现于1869年，一个转移性癌症患者的尸检报告中首次对此类细胞进行了描述[2]。约108个血细胞中可以检测到一个CTC即可提示肿瘤转移。具有强转移性和侵袭性的表型往往丢失了部分上皮细胞的特征而获得了更多类间质细胞特有的转移潜能，这也是CTC具有不同于一般肿瘤细胞的独特特征的相关机制[3]。以上过程被称为上皮-间质细胞转换（epithelialmesenchymal transitions，EMT），这种转换在疾病进展和肿瘤转移时均有发生，包括上皮细胞变成类成纤维细胞的外观改变、上皮细胞分化标记物（如细胞角蛋白和E-钙黏素）的下调，以及间质标记物（波形蛋白、纤连蛋白和N-钙黏素）的表达等改变[4-5]。

1 CTC和肺癌

在转移性乳腺癌[6-7]、结直肠癌[8]和前列腺癌[9]中，CTC与肿瘤的临床相关性已被确认。关于非小 细 胞 肺 癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）和CTC的相关性也已有诸多报道[10-11]。肺部恶性肿瘤中有75%～80%为NSCLC，绝大部分NSCLC患者在诊断时都已处于疾病晚期，患者缺乏有效的系统治疗，疾病经治疗后也容易复发，这导致了晚期NSCLC的总生存期（overall survival，OS）较短。临床分期是NSCLC患者最重要的预后因素，在早期NSCLC患者中年龄和性别也是重要预后因素[12]。目前晚期NSCLC患者的标准治疗方案为含铂双药化疗方案[13-14]，加或不加贝伐珠单抗[15]。部分确定存在表皮生长因子受体（epithelial grow th factor receptor，EGFR）基因活性突变或存在间变淋巴细胞激酶（anaplasticlymphomakinase，ALK）重排的NSCLC患者可以使用特异性的酪氨酸激酶抑制剂（吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼）或ALK抑制剂（克唑替尼）治疗，临床疗效明显优于标准化疗方案[16-18]。研究发现来源于原发肿瘤或转移部位的CTC中也可以检测到以上基因异常，因临床实践中获取新鲜的肿瘤组织经常比较困难，而利用血液样本分析CTC却可以常规进行，这就为肺癌患者的诊断和治疗提供了便利[1，19-20]。

2 CTC的富集和检测方法

可靠的CTC检测方法重复性好，并可以对CTC进行计数和特征分析。根据CTC的生物学或物理学特征，很多实验室都分别研究出了多种富集CTC的技术和方法[21]。但目前临床中尤其是肺癌研究中最常使用的方法主要有两种：①Cell-Search®系统（Veridex公司），是一种以上皮细胞黏附分子（epithelial celladhesionmolecule，EpCAM）为基础的免疫吸附富集系统；②ISET技术（Rarecells Diagnostics公司），是一种以过滤器为基础的通过上皮性肿瘤细胞的大小来分离的体积排除技术。

2.1 CellSearch®系统

CellSearch®系统是一个半自动化的技术，通过一种包被了抗EpCAM抗体的磁性纳米颗粒富集血液中表达EpCAM的细胞。富集的样本随后进行荧光标记，标记的抗体为白细胞标志物CD45和一组细胞角蛋白抗体，将EpCAM（+）CK（+）DAPI（+）CD45（-）的细胞界定为CTC。Cell-Search®系统的主要局限性是其不能检测EpCAM阴性的肿瘤细胞。但最近有研究发现在EpCAM阴性的CTC中有EMT表型相关的标记物（如CD146）的表达，可望改善这个系统的敏感性[22-24]。CellSearch®系统是目前唯一被FDA批准用于帮助提示乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的预后和检测治疗反应的程序[6，9，25-28]。

2.2 ISET技术

该技术是一种以过滤为基础的方法，根据细胞大小来分离CTC。用一个过滤装置过滤外周血，该装置含10个小格，可以同时加多个样本。和净化后的血细胞相比，CTC的直径较滤孔大（＞8mm）。从血样中捕获的CTC在细胞染色后可直接显示在滤器上，细胞的形态特征可得到很好的保留。过滤后，覆盖的滤膜进行自然干燥后，就可进一步进行染色和分析。通过这种方法可简化血样的处理，不需要利用上皮标记物来富集细胞。

2.3 CellSearch®和ISET的比较

根据表1，检验值（贵州民族学生F1均值）和标准值（美式英语母语使用者F1均值）的均值不同，其中F1检验值在紧元音和松元音中均略高于标准值，说明男性贵州学生总体较母语男性使用者开口度更大，因而舌位也较低，但两者不具有统计学意义上的显著性差异。

由Farace等进行的一项比较CellSearch®和ISET的研究[29]共入组了60例不同组织来源的转移癌患者，结果显示这两项技术在富集CTC细胞方面存在一些差别，其原因可能为CellSearch®只能捕获EpCAM阳性的细胞而漏掉了间质表型的细胞。Farace等[29]还认为，ISET除了能对CTC进行计数外，还能更精确地提示预后及为转移性肺癌患者的个体化治疗决策提供进一步的分子检测结果。

Krebs等[30]比较了使用两种方法分离未经化疗的Ⅲa～Ⅳ期NSCLC患者CTC的区别，并观察到了具有特异性上皮标记物表达的肿瘤细胞簇及其增殖状态。但是利用ISET方法能在80%的患者中检测到CTC，而通过CellSearch®方法只能检测到23%的阳性率。43%的患者通过ISET方法检测到了非增殖的肿瘤细胞簇而这些非增殖的细胞簇却不能通过CellSearch®方法检测到。该研究提示两种技术都能检测到晚期NSCLC患者的血样中存在CTC，但晚期肿瘤中EpCAM的低表达可能导致CellSearch®的敏感性降低。

Chinen等[31]报道了1例转移性NSCLC患者接受卡铂和紫杉醇治疗并在不同随访时间点监测CTC的结果。Chinen等在进行实验时平行使用以细胞角蛋白依赖性的免疫磁珠分离（上皮抗原依赖性）方法和ISET方法，结果显示免疫磁珠分离技术在反映患者的临床情况和疗效时不如ISET可靠。实际上，虽然免疫磁珠分离方法通过CTC数量的减少提示了治疗的疗效，但ISET（上皮性抗原非依赖性）反而显示了CTC数量有所增加，且后者的结果与临床情况恶化、治疗无效相一致。

2.4 其他富集和检测方法

为进一步提高CTC检测的敏感性和特异性，研究者们也对其他免疫标记抗体技术和新的分子鉴定技术进行了研究。非小细胞肺癌与其他肿瘤相比存在一些特异性的分子，如NSCLC细胞表面叶酸受体存在高表达。于跃等[32]通过免疫磁珠阴性富集方法捕获外周血中的CTC，再用肿瘤特异性叶酸配体-寡核苷酸耦合物标记捕获CTC，洗去没有结合的富余耦合物后，洗脱下特异性结合的耦合物的寡核苷酸用于定量PCR扩增分析，捕获的CTC通过免疫荧光染色鉴定为肿瘤细胞。结果显示，这一技术应用在153例NSCLC患者中检测灵敏度为73.2%，特异度为84.1%。

3 CTC对肺癌诊断的作用

有研究检测了CTC的可行性，并分析了其与肺癌的临床相关性。该研究入选了9例接受手术治疗的NSCLC患者，用CellSearch®系统分别检测了术前和术后患者血液中的CTC，结果发现术前有1例患者CTC为阳性，术后即刻有3例患者CTC为阳性，但10天后均变为阴性。且患者中位随访14个月无肿瘤复发，这也和患者CTC的变化相符合[33]。

Hoffman等[35]报道使用ISET技术能检测到NSCLC术后患者血液中的CTC。250例患者的血液样本分别由10名细胞病理学家随机加样到滤器上。其中恶性疾病患者、不确定恶性疾病患者及良性疾病患者分别有83%、12%和5%检测到了CTC；而作为阴性对照组的59例健康患者中则没有检测到CTC。

Hoffman等[36]将利用ISET方法得到的CTC的数量和患者的术前评估指标、病理分期及预后进行了相关性分析。208例血液样本来自于手术的NSCLC患者，39例阴性对照血样来自于健康人。有49%的NSCLC患者检测到了CTC，而健康人均未检测到CTC。中位随访24个月后发现，CTC≥50个/10 m l的NSCLC患者的术后无疾病进展生存期（progression-free survival，PFS）和OS都相对较短，且差异均具有统计学显著性意义（P=0.001和P=0.002），以上结果显示CTC能提示早期Ⅰ～Ⅱ期患者的高复发风险[36]。

4 CTC对肺癌预后的提示作用

一项研究联合CellSearch®和ISET富集并检测了210例手术切除的早期NSCLC患者的CTC。结果显示，与CellSearch®相比，ISET具有更好的提示预后敏感性的特点；而单变量分析和多变量分析的结果均显示，可检测到CTC（≥2个/7m l）的患者的PFS显著短于无CTC的患者（P＜0.0001）[37]。

Krebs等[38]通过一项单中心前瞻性研究对CTC在NSCLC患者中的预后作用及化疗对CTC的影响进行了探讨。101例未接受过化疗的Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者通过CellSearch®检测了CTC经过一个周期标准化疗前后的变化。21%的患者在基线状态时CTC＞2个/7.5 m l。单变量分析结果显示，Ⅳ期患者的CTC数量高于Ⅲ期患者，化疗前CTC＜5个/7.5m l的患者其PFS和OS显著优于CTC≥5个/7.5 m l者（P＜0.001）。且对70例患者CTC的一个周期化疗前后变化进行多变量分析后发现，CTC数量仍然是PFS的独立预后因素（P＜0.001），也是 OS的最重要的预后因素（P＜0.001）。

有两项荟萃分析结果[39-40]都阐述了CTC对肺癌患者预后的前瞻性。其中一项荟萃分析的结果提示，在基线状态时及治疗后外周血中存在CTC的患者预后较差。而且，晚期肿瘤患者更易检测到CTC；且CTC的检出率和治疗前患者的T（肿瘤大小）、N（淋巴结转移）、M（远处转移）分期相关，也和治疗后患者的T分期相关[39]。

另一项荟萃分析同样发现，存在CTC的NSCLC患者的预后差。该荟萃分析入选了分别使用了多种不同检测技术（RT-PCR、免疫细胞化学和CellSearch®等）的20项研究。统计学分析结果显示CTC和肿瘤大小、淋巴结受累情况及远处转移情况相关，但和组织学类型无关。而且，CTC阳性的NSCLC患者的PFS（P＜0.0001）和OS（P＜0.0001）均较CTC阴性的患者差[40]。

上述研究的结果提示，尽管CTC在分离方面尚存在一些问题，但随着检测技术的不断进步，使得CTC可能成为判断NSCLC预后的一个重要指标。

5 CTC分子学检测对于肺癌靶向治疗的指导意义

目前，NSCLC患者的初始治疗方案主要根据EGFR突变和ALK重排的检测结果来制定。这些突变结果可以预测患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂和ALK抑制剂的敏感性。但是，在晚期NSCLC中，通过活检取得的少量肿瘤组织有时并不够用于进行分子学检测。而通过检测CTC上存在的一些特殊蛋白并确定相关基因突变类型和分子特征，可有助于制定NSCLC的治疗策略和检测治疗疗效。

Maheswaran等[41]对比分析了分别利用转移性NSCLC患者CTC上的DNA和相应的血浆中循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）进行分子检测的可行性，并采用以过滤为基础的使用Ep-CAM包被抗体的CTC芯片（CTC-chip）技术。试验共分离了27例患者的CTC，并对其中12例患者的CTC进行了分子学分析。EGFR突变检测使用蝎形探针扩增阻滞突变系统法，或标准测序法或两种方法联合检测。除1例外，其他所有预测是阳性结果的患者（92%）的血液中都检测到了EGFR活性突变，包括那些接受了EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗的和含有T790M突变的患者。但是，使用以上方法学来评估EGFR突变状态尚需进一步的确认，而分析ctDNA中的基因组学改变则有望成为将来检测EGFR突变的新途径。

Punnoose等[42]在34例转移性NSCLC患者中研究了使用游离CTC进行生物标记物检测的可行性，发现通过免疫荧光法可以准确地测定24份CTC＞3个/7.5m l全血样本中的EGFR表达。Punnoose等[43]还发现用免疫荧光法分析EGFR突变表达及用定量的RT-PCR（qPCR）法对最常见的基因（AKT1、BRAF、EGFR、KRAS、NRAS、PIK3CA）改变进行突变分析有助于CTC和ctDNA的检测。根据CTC和ctDNA检测到的EGFR突变结果和相应的肿瘤组织的检测结果相吻合，也进一步确认了利用CTC进行突变检测的可行性；但是，该研究也显示，ctDNA的敏感性要高于CTC。

Ran等[44]报道了一项使用单个CTC来检测EGFR突变的新技术。为优化这种方法，来自NSCLC NCI-H1975细胞系（包含EGFR双突变：L858R和T790M）的10个细胞被加入到7.5 m l的全血中，使用标记有抗白细胞表面抗原抗体的磁珠阴性富集细胞，随后评估EGFR突变状态。CTC的富集和其上皮标记物表达水平无关，肿瘤细胞在切片上铺开后通过激光细胞显微解剖技术进行分离。将切片上的肿瘤细胞进行计数，拍照，并用337 nm的激光束进行单独的显微解剖，然后将肿瘤细胞放入细胞溶解液中，随后进行DNA基因扩增和PCR测序。95%的CTC产生PCR扩增子，85%可以确认有L858的突变，45%可以确认有T790M突变。来自5个病例的数据初步确认了在NSCLC患者中使用这种方法的可行性，但是还需要行进一步的研究来确认这些结果的可重复性，并需进一步的深入探讨。

Pailler等也研究了利用CTC检测ALK重排状态的最佳敏感性和特异性[45]。结果提示，在18例ALK阳性的NSCLC患者中筛查EML4-ALK融合基因是确实可行的。研究使用ISET方法富集CTC后在滤器上直接进行原位荧光杂交。所有组织标本中ALK阳性患者通过在CTC上均检测到了ALK重排，而在14例ALK阴性患者中仅1例在CTC上检测到ALK重排。

为进一步改善所富集的CTC的分子特征，增加CTC对诊断的帮助，并以此为根据来选择治疗手段，可能需要对扩增的PCR产物应用下一代测序（NGS）技术。NGS技术结合传统的一代测序技术（如Sanger），可望实现利用单个细胞和ctDNA来检测单个核苷酸突变或同时检测更多的基因改变的想法[46-47]。

6 CTC对于疗效的预测作用

很多研究都提示CTC计数可预测NSCLC治疗的疗效。但是，它和治疗反应的相关性是否可靠，首先取决于CTC检测方法的可靠性。在治疗的不同时间点，CTC数量会出现和疗效相关的动态变化，且这种变化所提示的疗效应该和治疗的临床疗效、实验室判定的客观疗效相符合。以此为终点，很多研究都显示了接受化疗的患者随访期间的CTC变化可能比标准的影像学技术（如CT和PET等）能提供更多相关疗效的信息。

Hirose等[48]的前瞻性研究评估了33例接受吉西他滨和卡铂化疗的转移性NSCLC患者的CTC计数变化和化疗疗效之间的相关性。CTC的检测采用CellSearch®方法，临界值为≥1个/7.5 m l。研究显示36.4%的患者CTC阳性，15.2%的患者基线时CTC数量≥5个/7.5m l。结果提示，CTC阳性患者和CTC阴性患者之间的化疗疗效无显著差别，但是CTC阳性患者中出现肿瘤进展的比例（66.7%）显著高于CTC阴性者（23.8%），且差异具有统计学意义（P=0.02）。

一项多中心Ⅱ期临床研究观察了41例接受厄洛替尼和帕妥珠单抗治疗的晚期NSCLC患者在治疗期间CTC变化对影像学疗效及临床疗效的预测意义，使用CellSearch®检测CTC[43]。结果显示，大部分患者（78%）都存在CTC，在基线时几乎有一半患者（42%）的CTC≥5个/7.5m l。其中高基线CTC和治疗疗效之间存在相关性（P=0.019）。而且，治疗后CTC的下降和更长的PFS相关（P= 0.05）。

另一项关于37例接受多西他赛和吉西他滨治疗的晚期NSCLC患者的CTC改变和临床疗效之间的相关性的研究也使用CellSearch®检测CTC，临界值为≥2个/7.5 m l，结果显示：24%的患者基线时CTC≥2个/7.5 m l。治疗2个月后（第3个周期化疗前）CTC阳性者具有更长的PFS（中位9.4个月）和OS（中位4.3个月），但差异无统计学意义[49]。

Muinelo-Romay等[50]报道了CTC在43例晚期NSCLC患者中的预后价值及其在监测化疗疗效时的作用。患者分别在基线状态、第2个周期及第5个周期进行含铂联合化疗前连续采血，用CellSearch®检测CTC，并主要计数形态上完整的CTC。其中CTC≥5个/7.5 m l的患者具有较低的中位PFS（4.1个月）和中位OS（4.6个月），而CTC＜5个/7.5m l的患者的中位PFS和中位OS分别为7.6个月和10.7个月，大部分患者在第2个周期化疗时CTC水平有明显下降，这提示CTC可预测患者接受治疗后的总体疗效，也提示CTC在治疗过程中有提示治疗是否起效的作用。

7 小结

大量研究已经显示CTC在提示NSCLC的肿瘤分期和转移发生中有显著作用，因此，将CTC检测转化到临床实践中并进一步改善标准化的CTC检测技术有重要意义。CTC可能成为临床上提示肺癌预后的重要因素，并可以在NSCLC患者的治疗期间通过反复取样来监测疾病进展。利用CTC检测肿瘤的分子标志物，也可为靶向治疗提供依据。

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R734.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.04.05

#通信作者（corresponding author），e-mail：zhanglipum ch@aliyun.com

2014-11-14）