黄樟素类化合物分析检测研究进展

李叶青，皮小弟，许洪勇，成 莲，曾石峭

(1.广东省河源市质量计量监督检测所，广东河源 517000;2.广东省河源市食品药品监督检测所，广东河源 517000)

黄樟素(safrole)(CAS:94-59-7)又称黄樟油素、黄樟脑，无色或微黄色液体，不溶于水，易溶于氯仿，乙醚和其他非极性有机溶剂［1－2］，有樟木气味，天然存在于肉桂、肉豆蔻、黑胡椒和紫苏等植物中，是许多食用天然精油如黄樟精油、八角精油和樟脑油的主要成分。由于其舒适的气味，黄樟油曾经在食品、洗涤用品和化妆品中作为调味剂和调香剂［3］。

黄樟素类化合物主要包括黄樟素、异黄樟素和二氢黄樟素等。黄樟素用来合成胡椒基丁醚和胡椒醛，胡椒基丁醚是农药的增效剂，胡椒醛用来调味，是香料的组分［4－5］。黄樟素也是非法生产毒品——摇头丸的一个重要组成部分［6］。异黄樟素和二氢黄樟素是黄樟素的衍生物，异黄樟素是黄樟素在氢氧化钾－无水乙醇溶液中加热异构化的产物，有类似茉莉醛的气息，香气强烈而持久;二氢黄樟素由黄樟素氢化而得，是合成农药增效醚的重要中间体，具有黄樟素类似的香气。

许多常见的香料，包括黑胡椒、可可、肉豆蔻、肉桂、龙蒿、八角、茴香、香菜、西芹、月桂、小茴香、香果和丁香都含有微量的黄樟素［7－8］。使用上述香料的软饮料中黄樟素的检出限为3～5 mg/L，可口可乐和百事可乐也包含其中［9］;酒精饮料含有0.15 ～3.00 mg/L［10］。

试验表明，黄樟素对老鼠有致肝肿瘤的效果。1960年12月3日，美国食品药品监督管理局(FDA)禁止食品中有黄樟素、黄樟油、异黄樟素和二氢黄樟素的存在［11］。2001年，欧盟委员会规定黄樟素和异黄樟素的总使用限量，食品和饮料中为1 mg/kg，含酒精饮料为5 mg/kg(酒精含量大于25%);含肉豆蔻食品为 15 mg/kg［3，12－13］。2005 年，欧洲委员会将黄樟素列为怀疑弱致癌物质，虽然没有规定每日限量，但要求设置的尽可能低，目前正在由欧洲委员会评估［14］。黄樟素的允许摄入量，欧盟委员会估计为0.3 mg/d，或成人以60 kg体重计0.005 mg/kg［12］;世界卫生组织估计美国人为 4 ～569 μg/d，欧洲人0.6 ～879.0 μg/d［15］。黄樟素 TD50为51 mg/kg［16］。

我国于2005年实施的《易制毒化学品管理条例》将黄樟素列为第一类易制毒化学品。由于黄樟素类化合物的毒副作用，建立准确、快速、简便的黄樟素类化合物分析检测方法，对于评估食品、化妆品及烟草的安全性有着重要作用。目前，常用检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱－串联质谱法(LC-MS/MS)、气相色谱法(GC)和气相色谱－质谱联用法(GC-MS)等，笔者简要概括了近年来国内外文献报道的黄樟素类化合物分析检测方法。

1 气相色谱与气相色谱质谱联用法

直接用气相色谱－火焰离子化检测器(GC-FID)定量或用气相色谱－质谱联用法(GC-MS)定性定量检测是目前测定黄樟素类化合物的主要方法。

2001年，Choong等采用GC-FID分析了软饮料中的黄樟素和异黄樟素［9］。样品未经处理直接进样，以1，4-二羟基苯(DHB)为内标定量，检出限为0.25 μg/ml。分析的25种软饮料中有20种检出目标物。

吴婷等为了同时分析吐司面包、番茄酱、广式香肠、可乐、葡萄酒中的黄樟素等多种成分，采用同时蒸馏萃取方法以二氯甲烷为提取剂将待测物从食品基质中分离出来，用1，4-二溴苯和乙酸苯乙酯为内标定量［17］。GC-FID测定黄樟素的方法检出限为0.2 μg/ml。待测物与内标物峰面积比值与浓度比值呈现良好线性关系，相关系数为0.999 54～0.999 73，空白加标回收率为 82.147% ～98.106%，相对标准偏差(RSD)为1.109% ～4.105%，通过对市场上5种食品的检测，表明该法可实现对样品进行灵敏、准确的定性定量分析。

王星等建立用气相色谱－质谱联用法测定化妆品中黄樟素、6-甲基香豆素的方法［18］。方法样品用甲醇提取，超声后定容，脱水，经0.45 μm 滤膜过滤，用GC-MS法定性，外标法定量。该方法条件下，黄樟素的加标回收率为101.3%～106.0%，RSD 为0.9% ～1.4%，测定限(以S/N=10 计)为 5 μg/g。

周贻兵等将烟用香精样品以甲醇超声提取，提取液经高速离心、0.45 μm 滤膜过滤后，供气相色谱测定［19］。采用SE-54毛细管柱分离样品，经FID检测，外标法定量。黄樟素的质量浓度在1.0～50.0 mg/L范围内与其色谱峰面积呈线性关系，方法的检出限(3S/N)为0.3 mg/L。黄樟素加标回收率在88.0% ～94.7%，RSD(n=6)在 0.8% ～4.5%。

李长于等采用乙醇超声提取，丙酸苯乙酯为内标进行定量，气相色谱－离子阱串联质谱法测定香精香料中黄樟素的含量［20］。选取黄樟素的母离子和子离子分别为m/z 162和m/z 131，内标丙酸苯乙酯选择m/z 104为定量离子。结果表明，黄樟素在0.05～5.00 mg/L范围内呈良好线性关系(r＞0.995)，方法的检测限(S/N=3)黄樟素为 0.002 mg/L，加标回收率为90.0% ～131.2%。

MAHESH·PAL等将肉豆蔻果实通过水蒸气蒸馏得到的挥发油通过GC和GC-MS进行分析［21］。代表该精油的95.9%的28种成分被确认:黄樟素含量为3.4%。

Queila P.S.Barbosa等对一种胡椒科植物的黄樟素含量通过GC-MS和GC-FID进行分析［22］。该组织叶、果实、茎的黄樟素含量分别为2.0%、4.8%和1.7%。GC检测条件为:DB-5 石英毛细管柱(30 m ×0.25 mm i.d.×0.25 μm)，起始柱温60℃，3℃/min升到240℃。

2 液相色谱与液相色谱质谱联用法

近年来，由于带有二极管阵列检测器(DAD)的液相色谱仪具有的定性定量检测的能力，使用DAD-LC检测黄樟素含量的报道较多，而LC-MS/MS比普通的LC有更高的分析选择性和灵敏度，越来越多的研究采用LC-MS/MS来分析复杂食品基体中的黄樟素。

王海利等建立了利用超高效液相色谱仪检测天然提取物中黄樟素含量的方法［23］。以无水乙醇为溶剂，振荡萃取黄樟素后，直接进样。经配置FLRD检测器的超高效液相色谱于激发波长288 nm、发射波长325 nm下对其进行检测。所得回归方程为:Y=5.51×106X+3.48×105，(R2=0.998 6，n=5)，平均回收率为95.1%，检测限为 38.3 ng/g。

Kurt A.Reynertson等建立了高效液相色谱定量检测一种香樟树皮中黄樟素的方法［24］，235 nm PDA检测，黄樟素标准物出峰时间约在20 min，回归曲线R2=0.999 9。该植物材料的甲醇提取物中黄樟素的含量为0.435%(W/W)(±5×10－6)，方法检测限定量限分别为1.25 μg/ml和3.75 μg/ml。

Chu Chen等建立了高效液相色谱法测定某些药材中的黄樟素和甲基丁香酚的含量［25］，Nucleosil 100-5 C18色谱柱(5 μm，250 mm ×4.0 mm i.d.)，外加保护柱(5 μm，8 mm ×4.0 mm i.d.);流动相为甲醇、四氢呋喃和水(52∶8∶40);流速为1.0 ml/min;检测波长为286 nm。分析表明，黄樟素在测试的干草药的含量范围为0.14～2.78 mg/g。

Kate Cummings建立了超快速液相色谱(UFLC)检测黄樟素的方法［26］。色谱条件为:YMC ODS-AQ S-8反相C18色谱柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm i.d.);流动相:(溶剂 A)蒸馏水，(溶剂B)乙腈。HPLC的条件如下:0～5 min(B)5%，5～10 min(B)15%，10～45 min(B)100%，保留10 min;进样量为10 μl;235 nmUV检测。黄樟素保留时间为(37.77±0.23)min，LOD 和LOQ 分别为1.514 mg/kg 和2.049 mg/kg。

3 我国现行检测分析标准

近年来，我国相继制定了一系列黄樟素的分析检测国家标准、行业标准或法规。标准方法中气相色谱是主要的检测手段。GB/T 14454.15－2008《黄樟油 黄樟素和异黄樟素含量的测定填充柱气相色谱法》以癸酸乙酯为内标，以GC-FID分析黄樟油中黄樟素和异黄樟素。SN/T 1783－2006《进出口化妆品中黄樟素和6-甲基香豆素的测定气相色谱法》中方法——采用甲醇超声提取化妆品中的黄樟素和6-甲基香豆素，GC-FID测定并以GC/MS确证。

4 结语

综上所述，黄樟素检测方法的研究开展的不算晚，主要集中在香精、香料及烟草中的研究。测定黄樟素类化合物的国家标准或法规还不多，并且这些标准或法规中多数只规定了1～2种物质的分析方法，相关文献报道的检测方法也大多是检测1～2种黄樟素类物质，而随着其他化合物的毒理学信息的报道及添加限量的控制，同时检测多种黄樟素类物质及其他化合物的分析标准可能将是今后制定标准的方向。

食品中黄樟素类化合物的检测还未见有标准方法的建立，目前，仅有试验研究报道采用液相萃取与色谱分离结合的方法分析食品中的黄樟素。黄樟素类化合物可用作天然除虫菊酯农药增效剂，随着除虫菊酯类农药的大量使用，必将造成它在食品特别是茶叶中的残留;黄樟素也曾是很多食品的添加剂，如用于饮料，但因其对人毒害较大，已禁止作为食品添加剂使用。食品中禁用物质的检测，准确定性至关重要，新技术、新方法的研究仍十分重要，相信食品中黄樟素类化合物的分析检测必将朝着准确化、快速化及多元化的方向发展。

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