鱼类MHC及其基因的研究进展

耿昕颖，王家祯，王巍，单晓枫，马红霞，高云航(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118)

主要组织相容性复合体(Major histocompitibility complex，MHC)是存在于脊椎动物的高度多态性基因组成的染色体结构，其编码蛋白样受体广泛参与特异性免疫应答的诱导和调节，对机体的免疫具有极为重要的意义。MHC最初是Gorer等在研究小鼠肿瘤细胞的排斥反应时发现的，从而引进的主要组织相容性复合体的概念。随后又在其他物种中相继发现MHC，人们发现该基因普遍存在于各种脊椎动物中［1］，MHC基因更是受到了极大的重视。1990年，Hashimoto等首次在鲤鱼(Cyprinus carpio)中发现了MHC基因，现在已经对几十种鱼类的MHC进行了研究，如鲤鱼［2］、真鲷［3］等。目前我国也对多种鱼类MHC基因进行了研究，如牙鲆［4］、草鱼［5］和紫红笛鲷［6］等。基于此，笔者对鱼类 MHC 及基因的研究进展进行了综述，以期为提高鱼类抗病性的育种选择提供理论基础和重要依据。

1 MHC分子的分类和结构

1.1 MHCⅠ类分子的结构 MHCⅠ类分子是一种糖蛋白，由α链和β2微球蛋白以非共价键形成的异源二聚体，均属于Ig超家族的成员。α链又称重链，分为α1、α2和α3胞外区、1个跨膜区和1个胞质区，每个功能区约含90个氨基酸残基，α1区和α2区的氨基酸顺序变化较大决定着Ⅰ类分子的多态性，鱼类的MHC I类分子分成经典的MHC Ia和非经典的MHC Ib两类。MHC Ia分子的α2、α3结构域中含有保守的多肽结合区、4个保守的半胱氨酸残基、CD8作用位点及β2-m结合位点等，在肺鱼和鲤鱼中还有N-糖基化位点。目前，研究发现已在鲤鱼、鲨鱼、虹鳟、斑马鱼中克隆到编码MHC Ia及MHC Ib分子的基因，MHC Ib分子多态现象明显，其功能与MHC Ia也有明显区别。

1.2 MHCⅡ类分子的结构 MHCⅡ类分子只存在于巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞等抗原递呈细胞表面以及胸腺上，所有的Ⅱ类分子是由α链和β链非共价结合的异二聚体，2条链的总体结构相似［7］，α链略重于β链，2条多肽链均为膜结合蛋白，跨越细胞膜伸入细胞内。鱼类的MHCⅡ类分子同样也是由2条α链(分子量约为32～34 kD)和2条β链(分子量约为26～29 kD)组成的异二聚体，分别由MHCⅡA基因和MHCⅡB基因编码。肽链分子量的大小及差异可能与所含糖基的不同有关，α链含有2个N-连接寡糖，β链含有1个N-连接寡糖。2条多肽链各由4个功能区组成，即2个胞外结构域(α1和 α2、β1和 β2)、1个含个氨基酸的30跨膜区和1个10～15个氨基酸的胞质区，结构上具有保守的多肽结合区、半胱氨酸残基及N-糖基化位点等。

1.3 MHCⅢ类分子的结构 MHCⅢ类分子由MHC区域内的另外一些基因编码，这些蛋白的功能相差较大。MHCⅢ类分子基因编码补体成分C1、C2、C3和 C4［8-9］，其他基因座分别编码21-羟化酶A和B、肿瘤坏死因子(TNF-α和TNF-β)和热休克蛋白70(Hsp 70)。MHCⅢ类分子不同于Ⅰ、Ⅱ类分子，它们不是膜结合蛋白，没有抗原呈递作用。

2 MHC的功能

2.1 MHC的免疫功能 MHC主要存在于特异性免疫抗原呈递细胞中，与机体免疫密切相关［10］，其功能是作为抗原呈递分子参与特异性免疫应答，并调节分子参与固有免疫应答［11］，调控免疫应答，在特异性免疫应答中起到重要作用，且具有许多与免疫有关的基因位点。MHC基因主要负责抗原呈递，Ⅰ类基因主要结合细胞内抗原，与来自胞内多肽结合槽结合成肽段，可结合β2-微球蛋白，形成稳定的MHCⅠ类-肽分子结合体，并把多肽呈递给CD+8T细胞，使T细胞活化进行细胞免疫。Ⅱ类基因主要负责外源性抗原的加工和呈递，它在内质网由α、β和γ链组成完整三聚体，γ链被蛋白酶水解后，抗原性多肽与MHCⅡ分子结合，形成稳定的MHCⅡ-抗原多肽复合物，运至细胞表面，在溶酶体中或线粒体中外源性抗原与MHCⅡ类分子结合后呈递给T淋巴细胞，从而引起特异性免疫应答反应。

2.2 MHC组织排异功能 MHC有组织性排异功能。这种排斥作用主要是由于供受体之间不同MHC分子个体之间的存在差异所引起的，表达相同的MHC分子的个体可以接受彼此的移植物，而表达不同的个体却有排异作用。最初在鱼类中发现MHC存在也是根据鱼类组织移植有排异现象而断定的，自Van等［12］发现鲤鱼中存在与高等动物MHC类似的免疫排斥反应体系以来，Cardwell等［13］在研究食蚊鱼的组织移植中也发现移植成功率与其MHCⅡ基因中DAB的3个位点的匹配率密切相关，当Ⅱ类基因DAB位点所有等位基因都相同时，成功率最高;有1个等位基因不匹配时，成功率较低;2个等位基因都不相同时，成功率最低。与硬骨鱼相比，软骨鱼和无颌鱼类中出现这种排斥作用表现的现对缓慢。Hashimoto等［14］发现鲨鱼对同种移植抗原和可溶性抗原的移植排斥现象较弱，而在无颌类只有慢反映现象。

3 MHC的表达规律

鱼类MHC基因的表达规律具有组织特异性。因为MHC基因有抗原呈递作用，因此其与免疫应答有直接关系，主要表达于脾、肾、胸腺、鳃等组织中。Hansen等［15］运用RNA印迹法克隆虹鳟鱼MHCⅠ类分子全长，发现MHCⅠ类基因在心、肠、肾、胸腺、脾脏以及头肾表达水平较强，在肌肉、脑、肝组织中表达较弱。在团头鲂中较强地表达于鳃、头肾和血液，中等程度表达于肝脏和脾脏［16］，而鮸鱼在肝脏中表达量最高［17］。Cuesta等［18］报道了金头鲷的 MHCⅡA 类基因在腹膜白细胞、头肾、脾、胸腺和鳃中表达量较高，在肠、脑、肝和外周血中表达量较低。

MHC基因组织表达的特异性还与鱼体自身免疫相关。Koppang等［19］应用RT-PCR技术研究发现大西洋鲑在受到大西洋鲑气单胞菌的刺激后MHCⅠ基因在肝、头肾表达水平明显增强，前肠明显下降，而在非免疫鱼中该基因在脾、鳃、肠中表达量较高，在心和脾中度表达，在头肾、肌肉、肝及脑中的表达量相对较低。此外，Koppang等还报道了非免疫的大西洋鲑的MHCⅡ基因仅在脾、鳃、前肠和后肠中表达，而免疫鱼在心、肝、脾、鳃、前肠和后肠均有检测到表达产物，特别是肝和鳃的表达水平显著提高。与组织表达相比，MHC在发育时期的表达研究较为少见。Fischer等［20］发现虹鳟MHCⅠα基因在受精7 d后开始表达，并且在胸腺中的表达量最高，而后期在肾和肝的淋巴细胞、上皮细胞和内皮细胞表达较强。与虹鳟相比，牙鲆［21］则在多细胞期、原肠期、囊胚期、神经胚期、尾牙期、心跳期6种不同发育时期均有表达，表达水平伴随着胚胎的发育时间其表达量逐渐增高。

4 MHC基因结构的多态性与抗病能力的关系

4.1 鱼类MHC基因的多态性 MHC基因具有高度多态性。MHCⅠ、Ⅱ类分子的抗原与外源肽和T细胞相互作用的部位是形成特定氨基酸的重要可变区域，其多样性直接影响MHC分子与不同抗原肽的结合特性［22］，进而导致不同个体对病原体易感性及抗病能力有所不同。Dijkstra等［23］发现虹鳟MHCⅠ类基因包含多个等位基因，其中MHCⅠβ基因的Onmy-UCA和Onmy-UDA分别有7个和8个等位基因，并且相似率超过80%。Akie Sato等［24］发现丽鱼MHCⅠ类基因组中存在17个基因位点，并对其中的AU705、AU706、AU501和AU507的多态性进行了分析，发现外显子2能明显影响这4个基因的多态性。

MHCⅡ类基因的多态性主要与位于相同基因座上的不同等位基因序列的差异等方面密切相关。Van等［12］报道MHCⅡB基因组中的Cyca-DAB*01、Cyca-DAB*02基因相似度为96.6%，其内含子长度均为204 bp;而Cyca-D(CB3)B、Cyca-D(CB4)B内含子长度分别为669和561 bp，但其相似度却达到89%。在个体水平上，铰口鲨［25］、大西洋鲑［26］、金头鲷［18］分别发现了2个、7个、11个MHCⅡA基因等位基因;MHCⅡB基因发现鲈鱼［27］、真鲷［13］、大西洋鲑［28］分别含有6、7、7 个等位基因。其中，大菱鲆和真鲷1个个体最多有6个和4个等位基因位点，牙鲆84个个体只能出现2个或2个以上的等位基因。

4.2 MHC基因结构的多态性与抗病能力的关系 MHC是脊椎动物体内与免疫应答调节密切相关的基因家族，因此MHC基因的多态性与抗病能力有重要的关系。Nathan等［29］研究发现虹鳟在感染细菌性冷水病病原菌时，MHCⅠ类基因能明显影响虹鳟的存活率，而MHCⅡ类基因则没有影响。Grimholt等［30］发现大西洋鲑在感染鲑鱼贫血病病毒时，MHCⅠ、Ⅱ类基因能明显影响大西洋鲑的存活率。我国学者对尼非罗非鱼［31］、“全红”体色瓯江彩鲤［32］、“粉玉”体色瓯江彩鲤［33］也进行了鱼体抗病关系的研究。

ZHANG Y X［34］通过对日本牙鲆的研究，将感染鳗弧菌的存活的牙鲆根据早期感染症状分为抗病组和易感组，试验发现13个MHCⅡB等位基因Paol-allele*a～m表达量有明显差异，结果表明抗病组还有大量的g、h等位基因，而易感组有大量的i基因。Hideki等［35］采用PCR-RF-SSCP技术在鲤鱼体内得到9种MHCⅡDAB基因A～K，鲤鱼在腹腔注射嗜水气单胞菌后，其中的6种基因型A～F在死亡和存活的鲤鱼个体中分布有很大差异，基因型C的鲤鱼存活个体数量是死亡个体数的3倍。

5 鱼类MHC基因的多态性研究的新技术及展望

鱼类MHC基因具有高度多态性以及连锁不平衡性的特点，可以为提高鱼类抗病性的育种选择提供理论基础和重要依据。根据不同的目的，研究鱼类MHC的方法也不相同，一些分子生物学技术已经成功应用于分析鱼类MHC基因结构与类别的差异，如单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性分析法(RFLP)、参考链介导的结合法(RSCA)和cDNA-PCR的宏基因组测序技术等。目前在研究MHC多态性过程中，通过不同的分析或结合法将不同的等位基因检测出来，再利用测序法明确其变异位点，从而能够更精确地研究鱼类MHC基因。除了研究鱼类MHC基因结构，还要预测分析这些分子的三维结构，从而判断MHC分子与特异性抗原肽的相互关系以及MHC在组织特异性表达是如何调控的，但是这些生物学技术还不够完善。鱼类MHC基因具有高度多态性以及连锁不平衡性的特点，可以为提高鱼类抗病性的育种选择提供理论基础和重要依据。随着对鱼类MHC免疫进化机制研究的不断深入，为揭示脊椎动物免疫系统的发展提供更多的途径。

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