鸡球虫病疫苗的研究及其临床应用

汪 凯，李文超，顾有方

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

鸡球虫病疫苗的研究及其临床应用

汪 凯，李文超，顾有方*

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

鸡球虫病是一种分布广泛，严重危害鸡生长发育的肠道原虫病。长期以来，主要依靠药物来控制鸡球虫病，由于球虫耐药虫株的出现，政府对抗球虫药使用的限制或禁止，使得用疫苗来控制鸡球虫病日益受到重视。本文对球虫疫苗的研究进展做一综述。

鸡球虫病；疫苗；进展

鸡球虫病是造成现代养禽业经济损失最大的疾病之一[1]，全世界每年由鸡球虫病造成的经济损失高达几十亿美元。我国是养鸡大国，占世界总养鸡量的1/10，每年由鸡球虫病造成的直接和间接经济损失更是难以估计。目前控制球虫病的主要方法仍然是使用抗球虫药，但由于耐药虫株，甚至多重耐药虫株的出现，公众对食品药物残留的日益关注，加上研制新药成本费用高以及政府对抗球虫药使用的限制或禁止，使得抗球虫药的进一步使用举步维艰，迫使人们寻找一种更好的方法来防治球虫病[2]。Beach等[3]首次报道鸡感染E.tenella后能够产生对同源株攻虫的抵抗力，揭开了球虫疫苗研究的序幕，1952年，世界上第一个商用活球虫疫苗Coccivac®诞生，时至今日，球虫疫苗的研究已取得了可喜的进展，并且已在养鸡业，尤其是蛋鸡和种鸡养殖中得到了较为广泛的应用，成为替代化药治疗球虫病的较为理想的可选方案之一，取得了较为明显的经济和社会效益[4]。本文对鸡球虫疫苗的研究进展及临床应用综述如下。

1 活球虫疫苗

由于感染鸡的球虫种类有多种，因此此类疫苗往往由不同种的球虫卵囊组成，有些还含有同一个种的不同虫株(如E.maxima)。总体而言，防治肉鸡的球虫活苗一般包括E.tenella，E.acervulina和E.maxima，防治蛋鸡的疫苗要尽可能含有鸡球虫所有种，尤其要有E.necatrix。依据球虫疫苗使用虫株的特征，可分为强毒活苗，弱毒活苗和耐离子载体药物活苗三类。

1.1 野生强毒球虫疫苗

最早用免疫的虫苗为自然活毒卵囊，这些虫株是直接从田间分离的，保持天然毒力，具有较强的致病性，这类疫苗以Coccivac和Immucox为代表。目前，这类疫苗广泛应用于世界上一些禽类养殖大国，已商业化应用了将近60年，如2001～2004年仅Coccivac®和Immucox®就销售了25亿头份[5]。

1.2 弱毒活球虫疫苗

由于强毒球虫疫苗使用的是直接从田间分离的强毒虫株，存在安全性较差的缺点。自上世纪70年代起，人们开始将目光转向人工筛选致弱球虫疫苗，并陆续获得了一系列致弱球虫株，以Paracox和Livacox等为代表。这一类疫苗一般是通过鸡体反复传代或通过鸡胚传代致弱而获得[6]，其内生发育时间缩短，大大降低了疫苗致病性，但保持良好的免疫原性，因此此类疫苗的使用可以避免野生强毒球虫疫苗的致病性问题，而且诱导的免疫保护作用不会出现其它较常用的活卵囊免疫带来的免疫效力下降的问题[7]，但是，早熟株的选育要经很多代的筛选，费时费力，而且卵囊产量较低，生产费用相对较高。

1.3 耐离子载体药物活苗

目前也发展了一些对全部或部分球虫药物有抗性的活球虫疫苗，如Nobilis®. COX ATM和VACM®。Nobilis®.COX ATM 是包含E.acervulina，E.maxima和E.tenella三个耐离子载体药物类的强毒疫苗。Li等[8]对三个田间分离强毒株，在致弱过程中选择了对离子载体具有抗性的虫株作为单一的多价口服疫苗，在免疫接种联合离子化载体组观察到了比接种免疫组或药物治疗组较好的效果。上述疫苗在肉仔鸡的早期预防治疗阶段，具有一定的优势，因为在鸡抗球虫免疫力发展不完全的前3～4周，可以在使用疫苗以产生对球虫的免疫力的同时使用离子载体类药物预防球虫病。这种联合使用由于在免疫力发展阶段减少了野毒株感染的压力，将进一步在鸡感染球虫病的总体风险。

2 亚单位疫苗

亚单位疫苗仅包含整个虫体中部分能刺激机体免疫系统效果较好的保护性抗原蛋白，而不含虫体的其它分子。和全虫疫苗相比，亚单位疫苗有着更高的稳定性、安全性和更低的副作用，因此受到广泛的关注。该类疫苗包括三种类型：(a)从天然组织中纯化的蛋白，(b)重组抗原蛋白以及(c)化学小肽疫苗。

商品化的配子体抗原疫苗Cox®Abic是迄今惟一可以称为“亚单位”疫苗的球虫疫苗，其通过诱导母源抗体来控制球虫病[9]。该疫苗含灭活的经亲和纯化的巨型艾美球虫配子体56，82和230 kDa蛋白。

对重组表达的亚单位疫苗而言，球虫生活史不同阶段保护性抗原的鉴别在其发展中至关重要。从抗原的虫种来源来看，抗原基因主要来源于E.tenella、E.acervulina、和E.maxima，从抗原来源的虫体阶段来看，主要集中在子孢子入侵相关蛋白上，包括折光体、微线、棒状体等细胞器抗原，其次是虫体表面的重组抗原。目前已鉴定出来的主要抗原有柔嫩艾美耳球虫的EtlA1、GX3262、Etrop/5、EtS3a、Et7b2、GX5401、Eth16、TA4、PGET10、PGET20、PGET30、PGET40、PEtk2、SO7、λMZS-7、AMA1、IMP等，堆型艾美耳球虫的EAMZp30-40、MA1、MA16、EalA、CMZ-8、CSZ-1、1P等，巨型艾美耳球虫的Em70/2、λgb、λb2、PEM70/1、gam56、gam82、AMA1、IMP等。这些筛选的球虫抗原基因，不少已经进行过免疫保护效果试验，具有良好的免疫原性和保护效力，这些为球虫疫苗的研究奠定了坚实基础。

3 DNA疫苗

目前，在球虫DNA疫苗构建上选用的载体主要为pcDNA和pVAX1，抗原主要来源于E.tenella、E.acervulina、E.necatrix和E.maxima，随着球虫抗原研究进展，越来越多的保护性抗原被筛选并构建成DNA疫苗。目前，针对E.tenella的DNA疫苗主要有pcDNA-SO7[10]、pcDNA-5401[11]、Pvax1-Rho[12]、pcDNA3.1-TA4和pcDNA3.1-Et1A-TA4[13]、pcDNA3.1-TA4-IL-2和pcDNA3.1-TA4[14]、pcDNA4.0-MZ和pcDNA4.0-MZ-IL17[15]、pVAX-SO7和 pVAX-SO7-IL-2[16]等。针对E.maxima的DNA疫苗有pcDNA-Gam56[17]、pVAX 1.0-EM8-IL-2[18]、pcDNA-AMA1和pcDNA-IMP[2]等。针对E.necatrix的DNA疫苗有pVAXl.0-NA4-IFN-γ、pVAXl .0-NA4-IL-2[19]。针对E.acervulina的DNA疫苗有pVAX1.0-3-1E- IFN-γ[20]、pVAX1-cSZ2和pVAX1-cSZ2-IL-2[21-22]、pVAX-LDH-IFN-γ和pVAX- LDH-IL-2[23]、pcDNA3.1-3-1E和 pcDNA3.1-3-1E-linker-mChIL-15[24-25]、pVAX1.0-cSZ-JN1[26]和pVAX1.0-cSZ-JN2[27]等。

4 重组活载体疫苗

目前在球虫疫苗研究中应用的活载体疫苗主要有沙门氏菌[28]、卡介苗[29]、乳酸菌[30]以及重组禽痘病毒[31]等, 抗原基因主要来源于E.tenella、E.acervulina、E.necatrix和E.maxima，抗原基因有E. tenella的SO7[31]、Rho[31]、ADF[32]、TA4[33]，E.necatrix的MIC2[34]，E.acervulinacSZ1[35]和E.maxima的AMA1[29]等。

5 可食用疫苗

在某种经遗传改造的植物细胞内表达球虫保护性抗原，即可以从植物细胞中提取纯化出重组蛋白免疫动物，也可以直接把转基因植物饲喂动物而获得免疫。在球虫疫苗研究领域，已经在烟草中成功表达了E.tenellaMIC2[36]，给鸡饲喂上述表达EtMIC2的烟草叶子可以导致较高的抗体反应和明显减少的卵囊分泌。表达EtMIC2和EtMIC2的烟草叶子联合饲喂鸡可导致较高的抗体水平和较好的体重增加[37]。

6 树突状细胞疫苗

树突状细胞(DC)是体内功能最强的抗原提呈细胞，可诱导很强的初次免疫应答。Del Cacho等[38]从E.tenella感染鸡分离CD45+的DC细胞，装载E.tenella子孢子，免疫试验显示与对照组相比试验组鸡体重获得增加，饲料转化率降低，粪便卵囊分泌减少，肠道病变减轻，死亡率较低。随后的试验显示分别装载E.tenella，E.acervulina和E.maxima子孢子抗原DC细胞来源的衍生泡免疫鸡均可以对相应同源虫株攻虫有一点的免疫保护力。

7 新型佐剂的研究

现有球虫基因工程疫苗由于在免疫保护效力方面的不足，尚不能替代球虫活疫苗，因此提高基因工程疫苗免疫保护效力成为一个亟待解决的问题。其中策略之一就是寻找合适的免疫佐剂。

细胞因子是一类能刺激活化和调节免疫细胞的可溶性小分子多肽或蛋白，目前已发现多种细胞因子如IL-2、GM-CSF和IFN-γ等具有佐剂效应，其与球虫重组蛋白/DNA疫苗一起免疫鸡后，能增强对球虫攻虫的免疫保护作用[39]。

含未甲基化的CpG基序的短寡脱氧核昔酸具有佐剂效应，可以增强天然免疫和诱导获得性免疫反应。Dalloul等[40]证实CpG ODNs可以增强鸡对球虫感染的抵抗能力，显示CpG ODNs可能是未来球虫重组疫苗的良好佐剂。

皂昔是从天然药物中提取的一类重要的生物活性成分，很多皂苷如Quil A具有佐剂效应，既能刺激外源性抗原产生Thl免疫应答，又能诱导产生细胞毒性T淋巴细胞。Du等[41]研究发现人参皂苷可以增强E.tenella重组抗原5401对同源株攻虫的免疫保护作用。Zhang等[42]发现包含人参皂苷的纳米粒子可以提高E.tenella重组profilin的免疫效力。免疫刺激复合物(ISCOMs)与植物皂苷及E.tenella抗原组装免疫刺激复合体免疫鸡，具有良好的保护效果，而且比Quil A毒性更低，可用于球虫的预防[43]。包括Quil A的新型佐剂QCDCR与profilin蛋白联用免疫鸡，攻虫后可显著降低感染鸡肠道病变[44]。随后试验证实profilin与QCDCR联用可以抵抗E.acervulina的感染[45]，而且profilin与QCDCR联用通过蛋内免疫可以提高后代鸡体重获得和细胞因子的表达水平。

8 展望

尽管球虫疫苗尤其是基因工程疫苗研制取得了巨大进步，但由于鸡球虫种类较多，基因组较大，保护性抗原的种类繁多，生活史复杂、发育阶段多，而且不同的发育阶段的基因表达情况也不一致等因素，迄今基因工程疫苗由于在免疫保护力方面不足而无法替代传统活苗。因此，未来需要进一步研究球虫虫体与宿主之间的相互作用，进而利用各种手段如基于细胞水平和糖水平的芯片技术、全基因组范围筛查方法等鉴别出各种重要的保护性抗原，进而采用合适的抗原传递系统，我们有理由相信球虫基因工程疫苗最终能在鸡球虫病的免疫防治中发挥重要作用。

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(责任编辑：马世堂)

Study on Vaccines Against Chicken Coccidiosis and Its Application

WANG Kai, LI Wen-chao, GU You-fang*

(College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Coccidiosis is a ubiquitous intestinal protozoan infection of poultry which seriously impairs the growth and feed utilization of infected chickens. Conventional disease control strategies rely heavily on chemoprophylaxis. The continual emergence of drug-resistant strains of Eimeria, coupled with the increasing regulations and bans on the use of anticoccidial drugs, prompts the development of vaccine against coccidiosis. This study reviews the latest advances in live and recombinant vaccine development against coccidiosis.

Coccidisos; Vaccine; Advance

2015-08-01

安徽省第七批“115”产业创新团队项目；安徽省教育厅重大项目(KJ2014ZD09)；安徽省教育厅重点项目(KJ2015A189)；安徽科技学院校级重点项目(ZRC2014406);安徽科技学院重点学科项目(AKZDXK2015A04)。

汪凯(1991-) ，女，安徽省池州市人，在读硕士研究生，主要从事动物寄生虫学与寄生虫病学研究。*通讯作者:顾有方，教授，E-mail:youfanggu@163.com。

S831.7

A

1673-8772(2015)06-0006-05