杨梅素诱导HeLa细胞凋亡的形态学研究

·论著·

杨梅素诱导HeLa细胞凋亡的形态学研究

刘师兵1,陈君2,吴少花3,

2,刘亚萌3,魏艳4,徐冶1*(

吉林医药学院:1.基础医学院,2.临床医学院,3.检验学院,吉林 吉林132013；4.吉林市中心医院呼吸内科,吉林 吉林132011)

摘要：目的研究杨梅素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡作用，并观察其形态学变化及凋亡相关蛋白的表达。方法体外培养宫颈癌HeLa细胞分为0、50、100、150 mg/L共4组，以观察杨梅素对宫颈癌HeLa细胞增殖率的影响。光镜观察不同浓度杨梅素对HeLa细胞生长的影响；共聚焦显微镜观察HeLa细胞核的形态变化及凋亡相关蛋白表达。结果与不加药物组相比，给予不同浓度的杨梅素导致HeLa细胞增殖率明显下降，出现凋亡形态学改变及凋亡相关蛋白active caspase-3表达增加。结论杨梅素引起HeLa细胞凋亡，且呈剂量依赖性。

关键词：杨梅素；宫颈癌；凋亡

文章编号：1673-2995(2015)06-0418-04

中图分类号：R73-3

基金项目：吉林省大学生创新创业项目资助课题(20141027).

作者简介：刘师兵(1982-)，女(汉族)，助理实验师，本科.

收稿日期：(2015-06-04)

Morphological study of HeLa cell apoptosis induced by myricetin

bLIU Shibing1,CHEN jun2,WU Shaohua3,DOU Minghan2,LIU Yameng3,WEI Yan4,XU Ye1*(1.School of Basic Meical Sciences,2.Clinical Medical College,3.Academy of Laboratory,Jilin Medical University,Jilin City，Jilin Province,132013;4.Department of Respiratory Medicine,Jilin Central Hospital,Jilin City,Jilin Province,132011,China)

Abstract:Objective To investigate the HeLa cell apoptosis induced by myricetin and observe its morphological changes as well as the expression of apoptosis related protein. MethodsHuman cervical cancer HeLa cell line was cultured in vitro and divided into following groups:control group and myricetin group (0，50，100，150 μg/mL).The optical microscope was used to observed the effect of myricetin on the growth of HeLa cells.The morphological changes of the HeLa cell nucleus and the expression of apoptosis related protein were examined under confocal microscope. ResultsCompared with the control group,the proliferation rate presents an apparent decrease in the different concentrations myricetin group.The apoptosis morphological changes appeared and the expression of apoptosis related protein active caspase-3 increased. ConclusionMyricetin induces apoptosis of HeLa cells in a dose dependent manner.

Key words:myricetin;cervical cancer;apoptosis

宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤。目前各种疗法都存在一定局限性[1]，因此寻求更加安全有效的治疗用药，对改善宫颈癌患者生活质量及提高生存率非常必要。本研究以宫颈癌HeLa细胞为模型，研究杨梅素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

通讯作者：徐冶(1972-)，男(汉族)，教授，博士.

人宫颈癌HeLa细胞由吉林医药学院医学科研实验室提供，用含10%标准胎牛血清的IMDM培养基于37 ℃，5%CO2条件下培养。实验用细胞均采用处于对数生长期。唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；胎牛血清(FBS)、IMDM培养基购自美国Gibco公司；杨梅素购自东京化成工业株式会社；二甲基亚(DMSO)、Hoechst33342、胰蛋白酶购自北京鼎国生物技术有限公司；活化半氨酸蛋白酶-3(active caspase-3)抗体购自美国Abcam公司；其他试剂为进口或国产分析纯。

1.2　细胞培养

人宫颈癌HeLa细胞用含10%胎牛血清的IMDM培养基，37 ℃，5%CO2培养箱内常规传代培养。

1.3　MTT检测杨梅素对细胞的半数抑制量(IC 50)

取对数生长期的HeLa细胞，0.25%胰酶消化后离心，按每孔含9×103个HeLa细胞加入96孔细胞培养板，37 ℃，5%CO2培养箱中培养过夜，使细胞完全贴壁。设立单加培养液空白对照组和不加药物阴性对照组以及不同浓度杨梅素实验组，以确定半数抑制量的药物浓度。每组实验浓度设4个重复孔，杨梅素浓度为：0、10、20、30、40、60、80、120、160 μg/mL；37 ℃，5%CO2培养24 h后，每孔加入20 μL MTT，培养箱继续培养4 h。弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min后，酶标读数仪测定光吸收度(OD值)，美国伯乐公司Model 680酶标仪，测定波长570 nm，分别计算不同浓度的杨梅素对HeLa细胞的生长抑制率。细胞生长抑制率=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(阴性对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.4　TT检测细胞存活率

操作步骤及条件同1.3，按照杨梅素浓度不同分为4组即0、50、100、150 μg/mL。

1.5　倒置相差显微镜观察细胞生长情况

待HeLa细胞培养至细胞完全贴壁加入药物，分组及给药方法同1.3。继续培养24 h后，显微镜下观察各组细胞的生长状况。

1.6　共聚焦显微镜观察细胞核形态变化

取处于对数生长期的HeLa细胞，0.25%胰酶消化后离心，按每孔5×104个细胞加入24孔细胞培养板。37 ℃，5%CO2培养箱中培养过夜，使细胞完全贴壁。分组及给药方法同1.3，37 ℃，5%CO2继续培养24 h。取出24孔板，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定25 min，用PBS洗3次。Hoechst33342染色5 min，PBS洗3次，甘油封片，共聚焦显微镜下观察取图。

1.7　间接免疫荧光法检测active caspase-3蛋白的表达水平

取处于对数生长期的HeLa细胞，0.25%胰酶消化后离心，按每孔5×104个细胞加入24孔细胞培养板。37 ℃，5%CO2培养箱中培养过夜，使细胞完全贴壁。分组及给药方法同1.3，37 ℃，5%CO2继续培养24 h。取出24孔板，吸掉各孔液体，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定25 min，再用PBS洗3次。蛋白酶K消化1 min，用PBS洗3次，0.1%TritonPBS作用7 min，PBS洗3次后，滴加5%非免疫动物血清作用30 min，一抗(anti active caspase-3 1∶200)4 ℃过夜，次日加入相应二抗，Hoechst 33342染色5 min，PBS洗3次，甘油封片，共聚焦显微镜下观察取图。

1.8　统计学分析

2　结　果

2.1　杨梅素对HeLa细胞增殖的影响

MTT法检测HeLa细胞生存率，杨梅素浓度为0、10、20、30、40、60、80、120、160 μg/mL时，HeLa细胞的增殖抑制率分别为0、(9.9±2.6)%、(22.5±6.0)%、(31.9±3.7)%、(38.3±3.1)%、(41.1±2.6)%、(42.4±3.4)%、(46.8±2.7)%、(60.5±3.2)%；结果表明：杨梅素对细胞增殖抑制作用随药物浓度增加而递增，细胞活力随浓度增加而降低，HeLa细胞的IC50为(100±1.69)μg/mL。与不加药物组相比，50、100、150 μg/mL浓度的杨梅素作用24 h均能明显抑制HeLa细胞的生长，细胞存活率分别为(55.9±5.0)%、(48.2±2.4)%、(40.3±1.0)%，差异具有统计学意义(P<0.05)，呈浓度依赖性关系。

2.2　光镜下观察细胞形态

HeLa细胞在加入不同浓度的杨梅素作用24 h后，镜下观察细胞生长情况发现：未加药物组细胞形态饱满，生长状态良好；50 μg/mL组部分细胞体积有所缩小，100、150 μg/mL组出现细胞变圆、体积缩小、漂浮的现象(图1)。

图 1　杨梅素对HeLa细胞增殖的影响(100×)

2.3　杨梅素对HeLa细胞凋亡的影响

2.3.1Hoechst 33342染色观察细胞核变化

激光共聚焦显微镜观察结果显示：与不加药物组相比，50、100、150 μg/mL的杨梅素处理HeLa细胞24 h后，均呈现出染色质浓缩、核染色增强、发生碎片和凋亡小体等凋亡特征性形态学改变，且随着药物浓度的加大，现象愈加明显，药物浓度在100 μg/mL时凋亡小体等形态学特征最典型(图2)。

图 2药物对HeLa细胞核形态影响(Bar=20 μm，400×)

2.3.2间接免疫荧光检测active caspase-3蛋白表达

激光共聚焦显微镜观察结果显示：与不加药物组相比，50、100、150 μg/mL处理24 h的HeLa细胞可观察到active caspase-3蛋白表达增强，且呈荧光点状聚集，随着药物浓度的加大，逐渐加强(图3)。

图 3　共聚焦显微镜观察active caspase-3蛋白表达

(Bar=20 μm、400×)

3　讨　论

杨梅素是天然存在于洋葱、莓类、葡萄和红酒中的黄酮醇类化合物,化学式为3，5，7，3＇，4＇，5＇-六基黄酮。杨梅素作为一种天然草本植物提取物，随着对其药理作用的深入研究，杨梅素抗肿瘤活性备受关注。一些学者在杨梅素对肺癌等癌细胞增殖抑制方面进行了一些初步探索[2-3]。

细胞凋亡是机体清除受损、衰老或多余细胞的一种程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)[4]。Caspase依赖的凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，目前公认的有线粒体途径、死亡受体途径及内质网应激3条主要信号转导途径，它们最终都能激活凋亡执行者caspase-3，它是细胞凋亡过程中的主要效应分子，活化的caspase-3被裂解后，可以剪切细胞凋亡过程中的许多关键蛋白，例如多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)。藏文巧等[5]的研究发现杨梅素通过上调Bad蛋白的水平，并与核糖体S6蛋白激酶2(ribosomal S6 kinase 2,RSK2)的氨基末端激酶域结合后发生作用，最终引起食管癌EC9706和KYSE30细胞凋亡。在另一篇报道中[6]证明了杨梅素通过靶向MAPK/ERK激酶和ERK信号通路发挥强大的抗癌活性。Xu Rongrong等[7]通过研究发现联合使用杨梅素和杨梅苷可以减少各自的用药剂量，降低不良反应，同时起增强对前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用。卞杰等[8]认为杨梅素诱导的肿瘤细胞凋亡属线粒体介导途径，韦伟等[9]的实验则显示杨梅素诱导膀癌细胞BIU-87凋亡，其机制与抑制survivin表达，上调caspase-3表达有关。Kim ME等[10]的研究发现杨梅素能够明显提高结直肠癌HCT-15细胞Bax/Bcl2的比值以及Bax的水平，从线粒体释放到胞浆的凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)增多，而caspase-3和caspase-9未被活化，也未出现细胞色素C的释放，证明杨梅素是通过Bax/Bcl2依赖途径和线粒体功能失调诱导凋亡，而并非caspase级联反应。本研究实验结果证明：杨梅素引起caspase依赖的HeLa细胞凋亡，并且具有剂量依赖性，其中150 μg/mL作用24 h凋亡率最高，100 μg/mL时凋亡小体等形态学特征最典型，active caspase-3蛋白的表达随着杨梅素浓度的增加而增加。杨梅素诱导HeLa细胞凋亡的具体机制仍不明确，弄清其中参与的蛋白与信号通路，还需更多的实验工作。

参考文献：

[1]陈春玲.宫颈癌诊治进展[J].中国处方药,2009(4):79-83.

[3]Araujo JR,Goncalves P,Martel F.Chemopreventive effect of dietary polyphenols in colorectal cancer cell lines[J].Nutr Res,2011,31(2):77-87.

[4]Wyllie AH.“Where,O death,is thy sting?”A brief review of apoptosis biology[J].Mol Neurobiol,2010,42(1):4-9.

[5]Zang Wenqiao,Wang Tao,Wang Yuanyuan,et al.Myricetin exerts anti-proliferative,anti-invasive,and pro-apoptotic effects on esophageal carcinoma EC9706 and KYSE30 cells via RSK2[J].Tumor Biology,2014,35(12):12583-12592.

[6]Lee ER,Kang GH,Cho SG.Effect of flavonoids on human health:old subjects but new challenges[J].Recent Pat Biotechnol,2007,1(2):139-150.

[7]Xu Rongrong,Zhang Ying,Ye Xingqian,et al.Inhibition effects and induction of apoptosis of flavonoids on the prostate cancer cell line PC-3 in vitro[J].Food Chem,2013,138(1):48-53.

[8]卞杰,顾明,侯胜燕,等.杨梅素抗肝肿瘤细胞HepG2作用及其机制的研究[J].中国医药导报,2012,9(36):7-9.

[10]Kim ME,Ha TK,Yoon JH,et al.Myricetin induces cell death of human colon cancer cells via BAX/BCL2-dependent pathway[J].Anticancer Res,2014,34(2):701-706.