人EpCAM蛋白胞外区基因原核表达载体的构建及鉴定

·论著·

人EpCAM蛋白胞外区基因原核表达载体的构建及鉴定

陈为1，2，李

1*，李强1，方芳1，张宸豪1，赵良中1，张

1，孟繁平2，崔逢德2(

1.吉林医药学院检验学院,吉林 吉林132013，2.延边大学医学院,吉林 延吉133002)

摘要：目的构建人EpCAM蛋白胞外区基因原核表达载体。方法通过聚合酶链式反应来扩增人EpCAM分子胞外区的编码基因，将目的基因克隆至T载体，通过酶切反应构建pET32a-EpCAM和pcold-TF-EPCAM重组表达载体。结果EpCAM胞外区基因成功与pET32a和pcold-TF质粒连接。结论本研究通过构建EpCAM胞外区的原核表达载体，为深入研究EpCAM分子的功能提供了实验基础。

关键词：EpCAM；

文章编号：1673-2995(2015)06-0409-03

中图分类号：R392

基金项目：国家自然科学

作者简介：陈为(1986-)，男(汉族)，助教，在读硕士.

收稿日期：(2015-05-23)

附分子；载体

Construction and identification of prokaryotic expression vector of human EpCAM protein extracellular domain gene

CHEN Wei1,2,LI Yan1*,LI Qiang1,FANG Fang1,ZHANG Chenhao1,ZHAO Liangzhong1,ZHANG Duo1，MENG Fanping2，CUI Fengde2(1.Academy of Laboratory,Jilin Medical University,Jilin City,Jilin Province,132013;2.Basic Medicine College of Yan Bian University,Yanji,Jilin Province,133002,China)

Abstract:ObjectiveTo construct prokaryotic expression vectors containing the extracellular domain gene of human

EpCAM. MethodsPCR the sequence of human EpCAM protein extracellular domain gene,the target gene was connected to T vector，and constructed pET32a-EpCAM and pcold-TF-EPCAM expression vectors by endonuclease reaction. ResultsEpCAM was successfully connected with pET32a and pcold-TF plasmids by gene sequencing. ConclusionThe construction and identification of human EpCAM protein extracellular domain gene expression vectors provided basis for its further research.

Key words:EpCAM；adhesion molecule；vector

1　材料与方法

1.1　实验材料和仪器

人EpCAM蛋白胞外区引物、2×PCR-MIX(天根生化科技有限公司)，人结肠cDNA模板、胶回收试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)，pGM-T克隆试剂盒(天根生化科技有限公司)，HindⅢ和XhoⅠ内切酶(宝生物工程有限公司)，pET-32a质粒(北京理化分析检测中心)，pcold-TF质粒(北京理化分析检测中心)，通用型DNA纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)，DH5ɑ感受态细胞(全式金生物技术有限公司)，酚蓝(AMRESCO)；MiSeq测序仪(Illumina)，PCR仪(Bio-Rad)，凝胶成像仪(Bio-Rad)，微量核酸浓度测定仪(岛津)，TS-1脱色摇床、恒温摇床(江苏太仓实验设备厂)，DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.2　目的基因片段的获得

根据人EpCAM蛋白胞外区基因序列，设计并合成特异性引物。以人结肠cDNA为模板，扩增目的片段。引物序列如下：HindIII-f酶切位点为CCCAAG-CTTGCCAGGAAGAATGTGTCTGTG,XhoI-r酶切位点为CCGCTCGAGTTTTAGACCCTGCATTGAG,产物长度为726 bp。PCR扩增仪扩增，取20 μL PCR产物进行经电泳鉴定，PCR扩增产物大小与预期相符，剩余产物进行胶回收。

1.3　克隆载体的构建及鉴定

目的基因片段与载体DNA片段按10∶1比例连接，瞬时离心，16 ℃低温循环水浴过夜。取10 μL转化DNA加入至50 μL DH5α感受态细胞中，混匀冰浴30 min，42 ℃水浴90秒，迅速移入冰中放置2～3 min。加入37 ℃ 500 μL LB培养基，37 ℃ 150 rpm振荡培养45 min。4 000 rpm/min离心1 min，保留约100 μL转化混合物涂筛选平板，37 ℃先正置培养30 min后，倒置培养过夜。选取阳性克隆(含重组质粒的白色菌落)接种于3 mL LB液体培养基(含100 mg/L Ampicillin)中220 rpm摇菌过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，检测质粒DNA浓度为208 mg/L。取10 μL进行测序，经序列比对，确认目的片段成功连接到T载体。

1.4　pET32a-EpCAM和pcold-TF-EpCAM重组表达载体构建及鉴定

依据酶切位点，利用HindⅢ和XhoⅠ两种限制性内切酶分别对T-EpCAM克隆载体和pET32a空载体进行酶切反应。37 ℃水浴过夜。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。将鉴定正确的酶切片段进行胶回收，将EpCAM目的片段与pET32a载体片段的胶回收产物进行连接，利用Ampicillin抗生素平板进行筛选，提取重组表达质粒并测序。经序列比对，目的片段已成功连接到质粒上。

依据酶切位点，利用HindⅢ和XhoⅠ两种限制性内切酶对T-EpCAM克隆载体和pcold-TF空载体进行酶切反应。将酶切产物直接过柱进行纯化，纯化产物直接进行连接，Ampicillin抗生素平板筛选，提取重组表达质粒并测序。经序列比对，pcold-TF-EpCAM重组成功。

2　结　果

目的片段琼脂糖凝胶电泳结果见图1。1泳道为人肝癌cDNA为模板PCR结果；2泳道为人结肠癌cDNA为模板PCR结果。酶切目的片段及pET32a载体糖凝胶电泳结果见图2,1-3泳道为酶切pET32a；4-5泳道为酶切T载体上的目的片段。pET-32a酶切产物胶回收浓度结果见表1。

图 1　以人结肠和肝癌cDNA为模板PCR目的片段

图 2　酶切目的片段及pET32a载体

酶切物浓度(mg/L)260/280目的片段221.98pET-32a载体232.01

3　讨　论

EpCAM基因结构上含有胞外域(extracellular region,EpEx)、跨膜区和胞内区(intracellular domain,EpICD)，由9个外显子组成，其中:外显子1编码信号，外显子2-6编码胞膜外区，外显子7编码跨膜区，外显子8编码15个氨基酸残基的胞内区，其中含有6个带正电荷的氨基酸簇，外显子9编码最后的13个氨基酸残基和终止码[4]。EpEx中包含两个表皮生长因子样结构域(EGF-like domain)，即EGF-like1和EGF-like2。EpICD可以激活Wnt信号转导通路并最终激活原癌基因c-myc，促进肿瘤细胞增殖；游离的EpEx可以加速EpCAM裂解，使EpICD的释放量增加，从而放大下游的信号转导[5-6]。

参考文献：

[1]Baeuerle PA,Gires O.EpCAM (CD326) finding its role in cancer[J].Br J Cancer,2007,96(3):417-423.

[2]Litvinov SV,Bakker HA,Gourevitch MM,et al.Evidence for a role of the epithelial glycoprotein 40(EpCAM) in epithelial cell-cell adhesion[J].Cell Adhes Commun,1994,2(5):417-428.

[3]张葵.抗人EpCAM 单链抗体的制备及其应用研究[D].西安:第四军医大学,2011.

[4]Liunebnach AJ,Seng BA,WUS,et al.Retroposition in a family of carcinoma-associated antigen genes[J].Mol Cell Biol,1993,13(3):1507-1515.

[5]Maetzel D,Denzel S,Mack B,et al.Nuclear signalling by tumour-associated antigen EpCAM[J].Nat Cell Biol,2009,11(2):162-171.

[6]蒿慧文,王寅炤,郑燕森,等.CD326分子胞外区表皮生长因子样结构域融合蛋白的表达与纯化[J].细胞与分子免疫学杂志,2012,28(9):923-925.

[7]Went PT,Lugli A,Meier S,et al.Frequent EpCAM protein expression in human carcinomas[J].Hum Pathol,2004,35(1)：122-128.