磷脂酶D催化精制蛋黄磷脂酰胆碱研究

赵艳艳，程敏，张晓文

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛726000）

磷脂酶D催化精制蛋黄磷脂酰胆碱研究

赵艳艳，程敏，张晓文

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛726000）

选用磷脂酶D作为工具酶，在异辛烷、正丁醇和水构成的微乳体系中，进行了蛋黄磷脂酰胆碱的精制研究。结果表明，合理的工艺条件为：卵磷脂浓度为0.24 g·m L-1，卵磷脂与氯化胆碱质量比为7:1，加酶量为11.0 mg·m L-1，反应温度为40℃，反应起始pH为4.0，在该工艺条件下得到磷脂酰胆碱的转化率达84.5%。

蛋黄磷脂酰胆碱；氯化胆碱；磷脂酶D；催化精制

卵磷脂（PC）是分布在自然界的一类含磷脂类物质，是人体各种生物膜的构成物质，同时也是胆碱和必需脂肪酸的主要来源，对调节机体的正常代谢，起着重要的作用[1-2]。磷脂酰胆碱是细胞膜的重要组成物质，同时也是脑细胞传递信息的生物活性物质，其在体内水解，可以释放出胆碱，胆碱通过合成乙酰胆碱调节脑神经系统的正常活动，提高脑细胞活力[3]。目前，磷脂酰胆碱的提取精制方法有有机溶剂萃取法、柱层析法、超临界二氧化碳流体萃取法、酶催化精制法等。Mary C等[4]采用丙酮沉淀法，制得卵磷脂粗品，然后用CdCl2和卵磷脂生成复合盐沉淀，精制蛋黄磷脂酰胆碱。该法适合于制备粗磷脂，且在制备过程中带来了有机溶剂残留，提取效率低；许海丹等[5]通过硅胶柱层析法和三氧化二铝柱层析法精制蛋黄磷脂酰胆碱，得到了纯度90%以上的磷脂酰胆碱，该法可以制备高纯度的磷脂酰胆碱，但不适宜于工业化生产；Henry Y S H等[6]用有机溶剂萃取后，采用超临界CO2流体萃取技术进行萃取得到较纯的卵磷脂，但是萃取的后期会出现蛋黄粉结块而使得收率降低，需要的仪器设备也比较昂贵；Lekh R J等[7]采用磷脂酶催化法精制蛋黄磷脂酰胆碱，结果得到含量高达95%以上的磷脂酰胆碱。酶催化法精制磷脂酰胆碱，条件温和，酶可以重复利用，产品收率高[8]。本研究采用磷脂酶D催化法精制蛋黄磷脂酰胆碱，首先以蛋黄卵磷脂为底物，磷脂酶D作为催化剂，其亲核基团Y攻击卵磷脂的酯键，形成卵磷脂与磷脂酶D的共价中间复合物，并从卵磷脂中释放出一个带负电荷的基团。此后，加入另一底物氯化胆碱。在氯化胆碱的攻击下，底物—酶共价复合物解离，释放出游离的酶，胆碱分子与酯键结合，生成新的磷脂酰胆碱，达到对卵磷脂的精制作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

蛋黄卵磷脂粗品（实验室自制）；氯化胆碱（购自湖北巨胜科技有限公司）；Phospholipase D（购自意大利kinetika公司）。

1.2 酶催化法精制磷脂酰胆碱的合成机理

酶催化法精制磷脂酰碱的流程图见图1。

图1 磷脂酰胆碱合成的流程图

1.3 蛋黄卵磷脂粗品的制备

蛋黄粉的主要成分是卵磷脂、蛋黄油和卵黄蛋白。可以根据卵黄蛋白不溶于乙醇，而卵磷脂和蛋黄油都可溶于乙醇的原理，用乙醇提取卵磷脂；接着根据蛋黄油可溶于丙酮，卵磷脂极性较蛋黄油大，不溶于丙酮的原理，用丙酮萃取，制备蛋黄卵磷脂粗品。

称取一定量的蛋黄粉，加入无水乙醇（料液比为1:15）在40℃的恒温水浴锅中提取4 h，过滤，将滤液减压浓缩。在浓缩液中加入一定量的丙酮，搅拌，得到大量沉淀。离心分离沉淀，在70℃下烘干，制得蛋黄卵磷脂粗品。

1.4 微乳体系的构建

卵磷脂的亲脂性强，称取一定量的卵磷脂，加入到异辛烷中，超声溶解，待完全溶解后，加入正丁醇作为助表面活性剂（卵磷脂：异辛烷：正丁醇=2 g：7 mL：1 mL），在40℃、转速100 rpm的搅拌下，缓慢加入3 mL酶溶液，形成半透明的微乳体系。其中，卵磷脂不仅是反应的底物，也是微乳体系的表面活性剂，正丁醇是助表面活性剂，异辛烷和含酶的缓冲液分别构成了有机相和水相。

1.5 磷脂酶D催化精制磷脂酰胆碱

称取一定量氯化胆碱（卵磷脂与氯化胆碱质量比为7:1），用pH=4的Buffer溶液溶解后，缓慢加入到1.4所构建的微乳体系中，在40℃、转速100 rpm的搅拌下，反应4 h（2.5 h后微乳体系开始破坏）。反应结束后，加入1 mol·L-1的NaOH溶液，在30℃下反应1 h，使得氯化磷脂酰胆碱转变为磷脂酰胆碱。加入甲醇：水（95:5）进行第一次萃取，将萃取液减压浓缩后，加入水进行第二次萃取，取萃余相，浓缩，得精制的蛋黄磷脂酰胆碱。

2 结果与讨论

2.1 卵磷脂浓度对反应的影响

本研究的底物为卵磷脂和氯化胆碱。在异辛烷：正丁醇：水=7 mL：1 mL：0.5 mL构成的微乳体系中，反应温度40℃、反应时间4 h，初始pH4.0，加酶量11.0 mg·mL-1、卵磷脂和氯化胆碱的质量比为7:1的条件下，研究卵磷脂浓度分别为0.06、0.12、0.24、0.36、0.48 mg·mL-1对反应结果的影响，结果见图2。

由图2可以看出，当卵磷脂浓度较低时，磷脂酰胆碱转化率较低，随着底物浓度的增加，磷脂酰胆碱的转化率增加，当底物浓度大于0.24 mg·mL-1，磷脂酰胆碱的转化率不再随着卵磷脂浓度的增大而增加，其原因为：根据酶—底物中间复合物学说，磷脂酶D首先与卵磷脂结合，生成中间复合物，中间复合物再和氯化胆碱反应，生成磷脂酰胆碱，释放出磷脂酶D。当卵磷脂浓度较低时，卵磷脂以单分子形式分散在微乳体系中，形成一些胶束，从而增加了和磷脂酶D结合的几率，在磷脂酶D的作用下，卵磷脂分子亲脂基团解离，氯化胆碱连接在酯键上，生成磷脂酰胆碱。但是随着底物浓度的增加，独立分散的卵磷脂分子堆叠在一起，影响了磷脂酶D与底物的结合，降低了酶解反应的转化率。因此，反应的最适底物浓度为0.24 mg·mL-1。

图2 卵磷脂浓度对反应的影响

2.2 温度对反应的影响

在异辛烷：正丁醇：水=7 mL：1 mL：0.5 mL构成的微乳体系中，固定反应时间4 h，初始pH4.0，加酶量11.0 mg·mL-1、卵磷脂浓度0.24 mg·mL-1、卵磷脂和氯化胆碱的质量比为7:1的条件下，研究反应温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃对反应结果的影响，结果见图3。

从图3可以看出，随着温度的增高，磷脂酰胆碱的转化率增加，在40℃时达到最高。接着随着温度的升高，磷脂酰胆碱的转化率反而下降。因为温度对酶的催化反应有着复杂的影响，可能的机理是当反应体系温度升高，单位时间内分子运动速度增加，卵磷脂与磷脂酶D的有效碰撞次数增加，从而增加了酶与底物的接触点，使得酶——底物共价复合物增多，在氯化胆碱的攻击下，生成新的磷脂酰胆碱，释放出游离的酶，从而使磷脂酰胆碱的转化率增加。当酶促反应达到最适温度时，再提高温度，会导致磷脂酶D部分失活，反而使得酶促反应速率下降，磷脂酰胆碱转化率下降。同时，高温会使得氯化胆碱的季铵盐基团发生霍夫曼降解反应，从而影响磷脂酰胆碱的转化率，并给反应体系带来新的杂质。

图3 温度对反应的影响

2.3 pH对反应的影响

在异辛烷：正丁醇：水=7 mL：1 mL：0.5 mL构成的微乳体系中，固定反应时间4 h，反应温度40℃，加酶量11.0 mg·mL-1、卵磷脂浓度0.24 mg·mL-1、卵磷脂和氯化胆碱的质量比为7:1的条件下，研究pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5对反应的影响，结果见图4。

图4 pH对反应的影响

由图3可以看出，pH对反应有一定的影响，随着pH的增加，磷脂酰胆碱的转化率增大，但是当pH大于4后，磷脂酰胆碱的转化率随着pH的增加反而下降，这是因为pH调节是提高酶在有机溶剂中催化能力的重要方法，pH通过对酶分子结构的稳定性和解离状态产生影响，从而影响酶分子的活性。当pH较低时，磷脂酶D的活性基团保持解离状态，从而使磷脂酶D保持较高的活性，催化卵磷脂的酯键断裂，形成底物——酶共价复合物，从而提高产物的转化率，随着pH的增大，磷脂酶D的活性增强，磷脂酰胆碱的转化率增大，但是当pH大于4.0以后，磷脂酶D的活性降低，产物的转化率降低。所以，反应的最适pH为4.0。

2.4 反应时间对磷脂酰胆碱转化率的影响

在异辛烷：正丁醇：水=7 mL：1 mL：0.5 mL构成的微乳体系中，固定反应起始pH为4.0，反应温度40℃，加酶量为11.0 mg·mL-1、卵磷脂浓度为0.24 g·mL-1、卵磷脂和氯化胆碱的质量比为7:1的条件下，研究反应时间为2、3、4、5、6 h，磷脂酰胆碱的转化率，结果见图5。

由图5可知，反应在2-4 h，磷脂酰胆碱的转化率随着反应时间的增加而增大，并逐渐趋于平衡。4 h后，继续延长反应时间，磷脂酰胆碱的转化率变化不明显，主要原因可能为两个方面：第一，磷脂酶D在微乳体系中活性较高，当反应2.5 h后，微乳体系开始破坏，到4 h微乳体系完全破坏，导致酶活性下降，磷脂酶D和卵磷脂形成的共价复合物减少，导致磷脂酰胆碱的转化率不再增加；第二，反应的底物为卵磷脂和氯化胆碱，随着反应时间的延长，卵磷脂和氯化胆碱不断消耗，酶与卵磷脂的结合位点减少，磷脂酰胆碱的转化率增加缓慢，当反应4 h以后，底物基本消耗完全，磷脂酰胆碱的转化率增加不再明显。所以最适反应时间为4 h。

图5 反应时间对磷脂酰胆碱转化率的影响

2.5 Ca2+对反应的影响

磷脂酶D的催化反应对Ca2+具有依赖性。在异辛烷：正丁醇：水=7 mL：1 mL：0.5 mL构成的微乳体系中，固定反应时间4 h，反应温度40℃，起始pH4.0，加酶量11.0 mg·mL-1、卵磷脂浓度0.24 mg·mL-1、卵磷脂和氯化胆碱的质量比为7:1的条件下，在反应体系中分别加入0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL氯化钙CaCl2溶液（1 mol·L-1），研究Ca2+对磷脂酰胆碱转化率的影响，结果见图6。

图6 Ca2+对磷脂酰胆碱转化率的影响

由图6可知，加入0.2、0.4 mL CaCl2溶液的反应体系和不加CaCl2溶液的反应体系，磷脂酰胆碱的转化率没有明显变化，而随着Ca2+浓度的增加，磷脂酰胆碱的转化率逐渐下降，可能原因是：磷脂酶D的催化反应对Ca2+具有依赖性，Ca2+通过与酶分子联接，改变酶分子的构象，提高酶活，促进磷脂酰胆碱转化率的增加。由于蛋黄中本身含有Ca2+，能够与磷脂酶D结合，使得反应维持较高的速率，所以加入0.2、0.4 mL CaCl2溶液的反应体系和不加CaCl2溶液的反应体系，磷脂酰胆碱的转化率没有明显变化。但是随着Ca2+浓度增加，一方面Ca2+与卵磷脂形成配合物沉淀，不利于酶与底物形成共价复合物，另一方面，高浓度的Ca2+会使得蛋白质发生变性，酶分子失活，导致磷脂酰胆碱转化率降低。因此，本反应不需要加入Ca2+。

3 结论

本研究以磷脂酶D作为工具酶，对实验室制备的蛋黄卵磷脂粗品进行精制，得到优化的反应条件为：以异辛烷：正丁醇：水=7:1:0.5构成微乳体系，卵磷脂浓度为0.24 mg·mL-1，卵磷脂与氯化胆碱质量比为7:1，加酶量11.0为mg·mL-1，反应温度为40℃，反应起始为pH为4.0。在该条件下，磷脂酶D能够较好的与底物结合，将其他磷脂转变为磷脂酰胆碱，从而达到对卵磷脂的精制。

[1]孙清瑞,鹿保鑫,刘志明,等.化学催化法制备甘油磷酸胆碱的研究[J].粮油加工,2009,11(11):56-58.

[2]赵艳艳.甘油磷酸胆碱的稳定性研究[J].商洛学院学报,2013,27(6):75-77.

[3]常皓.蛋黄卵磷脂的提取、分析及氧化稳定性研究[D].长春:吉林大学,2012:35-37.

[4]Mary C,Pangborn.A simplified purification of lecithin[J].J Biol Chem,1951,188:471-476.

[5]许海丹.蛋黄卵磷脂的精制工艺及其稳定性研究[D].杭州:浙江大学,2005:24.

[6]Henry Y S H,Mehdi A K,Larry T,et al.Analytical scale supercritical fluid fractionation and identification of single polar lipids from deoiled soybean lecithin [J].J Sep Sci,2008,31:1290-1298.

[7]Lekh R J,Tsuneo Y,Sholchi S.Enzymatic method of increasing phosphatidylcholine content of lecithin[J]. JAOCS.1989,66(5):714-717.

[8]秦德元,张鹏.酶法合成EPA／DHA型卵磷脂[J].中国油脂，2004,29(9):45-47.

（责任编辑：李堆淑）

Catalytic Purification of Egg Yolk Lcithin by Phospholipase D

ZHAO Yan-yan，CHENG Min，ZHANG Xiao-wen
(Collgeg of Biopharmateutical and Food Engineering,Shangluo University，Shangluo 726000,Shaanxi)

Egg yolk lecithin was purified by phospholipase D in microemulsion system which was made by isooctane,n-butanol and water.The optimum reaction conditions were as follows:the concentration of PC was 0.24 g·mL-1，mass ratio of PC to choline chloride was 7:1,lipase D dosage was 11.0 mg·mL-1,reaction temperature was 40℃,reaction pH was 4.0.Under the optimum conditions,the conversion rate of phosphatidylcholine was 84.5%。

egg yolk lecithin;choline chloride;phospholipase D;catalytic purification

R927

A

1674-0033（2015）06-0067-04

10.13440/j.slxy.1674-0033.2015.06.016

2015-10-15

商洛学院科研基金项目（13SKY011）

赵艳艳，女，陕西洛南人，硕士，讲师