地塞米松诱导小鼠腭裂及E-钙黏素基因表达的研究

庞骁霄 李丽 马利 郑谦 李承浩

口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院唇腭裂外科（四川大学），成都 610041

非综合征型唇腭裂是颌面部最常见的先天性发育畸形，其病因复杂，目前认为与基因和环境因素有关。环境因素中如糖皮质激素类、四氯二苯对二恶英等均可诱发先天性腭裂。地塞米松（dexamethasone，DEX）作为糖皮质激素家族中的一员，具有较高的致畸风险，但具体致畸机制目前尚未清楚。有研究[1]发现，在正常腭融合过程中，腭突上皮细胞中E-钙黏素（E-cadherin）的表达受到抑制，导致腭中嵴上皮缝（medline epithelial seam，MES）裂解并形成上皮岛，最终完成腭突融合。E-cadherin是一种重要的黏附分子，在上皮融合过程中发挥重要作用。在此基础上，本研究通过注射DEX于孕鼠腹膜下，研究DEX作用下腭突中E-cadherin基因的表达情况，进一步探讨DEX对腭突发育的影响及导致腭裂的发病机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 8周龄C57BL/6J小鼠（购自四川大学实验动物中心），质量25～30 g，雌雄分笼饲养于SPF级动物房。实验动物自由摄食饮水，给予充足食物。饲养房的温度为20～25 ℃，分别给予光照与黑夜12 h，相对湿度20%～30%。雌雄合笼过夜，比例为2∶1，于晚18:00合笼，并于次日早7:30检查雌性小鼠的阴栓，查见阴栓之日定为孕0 d（embryonic day，E0），称重放入空笼饲养并做好记录。对E10.0的小鼠再次称重，如体重增加2 g以上则确定怀孕。

1.1.2 实验试剂和器材 生理盐水（normal sodium，NS）（湖南科伦制药公司），DEX（Sigma公司，美国），兔抗鼠E-cadherin抗体和试剂盒（ZYMED公司，美国）等。体视显微镜、光学显微镜，由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及给药 孕鼠随机分为实验组和对照组，每组8只。实验组及对照组孕鼠于E10.0—E12.0每天称重后分别于腹膜下注射DEX和NS，DEX剂量为6 mg·kg-1，NS为每只0.1 mL。

1.2.2 标本获取及染色 在E13.5、E14.5、E15.5、E17.5用颈椎脱臼法处死孕鼠，无菌环境中取出胚胎。将胎鼠头部通过脱水、透明、浸蜡及包埋制成5 μm厚切片，切片脱蜡水化。对标本行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，置于光镜下观察腭部的组织学变化。孵化兔抗小鼠E-cadherin抗体对标本进行免疫组织化学染色，采用SABC法，抗体稀释度为1∶200，DAB显色，苏木精轻度复染，透明后经中性树胶封片，置于光学显微镜下观察。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）定量分析 体视显微镜下剪取E14.0、E14.5、E15.5的胎鼠腭突，置液氮中保存，将胎鼠腭突组织匀浆，用Trizol试剂提取组织中的总RNA，利用SYBR Premix Ex TapTMⅡ试剂盒（TaKaRa公司，日本）进行real time-PCR，对E-cadherin和β-钙黏素（β-catenin）mRNA的表达水平进行定量分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为目的基因的CT值参照。引物序列见表1。real-time PCR反应在ABI PRISM 7300系统（ABI公司，美国）中进行，反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40个循环。

1.2.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，统计方法采用t检验和卡方检验，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 DEX诱导腭裂发生的情况

DEX组胎鼠共39只，17只出现腭裂，22只腭突融合，腭裂发生率为43.59%（17/39）；对照组胎鼠共33只，1只出现腭裂，32只腭突融合，腭裂发生率为3.03%（1/33）。经统计学检验，2组的腭裂发生率有明显差异（P＜0.05），DEX组明显高于对照组，说明DEX具有较高的致畸性。

2.2 HE染色观察

对照组和DEX组胎鼠的腭部形态如图1所示。E13.5，对照组胚胎舌体开始下降，腭突开始上抬并沿舌体两侧垂直向下生长；而DEX组胚胎舌体位置较高。E14.5，对照组舌体降至口底，两侧腭突上抬至舌体上方呈水平位，腭中嵴上皮在中线区形成MES；DEX组腭突位于舌体两侧开始上抬，上抬不规律且短小，两侧腭突不接触。E15.5，对照组MES消失，间充质细胞相互连接形成完整的腭突；DEX组腭突在舌体上方呈水平生长，两侧腭突体积短小，不能在中线区相互接触致形成腭裂。E17.5，对照组腭部发育基本完成，DEX组腭突短小，不能与鼻中隔完全接触，腭裂形成。

图1 对照组和DEX组胎鼠在不同时间的腭部形态 HE × 100Fig 1 Palate morphology of the mouse in the control and DEX groups at different time HE × 100

2.3 免疫组织化学染色观察

E-cadherin在腭突主要表达于上皮中，其染色阳性部位在细胞膜上。对照组和DEX组胎鼠的免疫组织化学染色结果见图2：以细胞膜染成淡黄色或棕褐色者作为阳性细胞，可见E-cadherin在细胞膜中高表达，细胞质与细胞核未检测到明显的表达。E13.5时，对照组腭突上皮呈现棕黄色，间充质中未见明显棕黄色出现，DEX组腭突上皮中呈现棕黄色染色，但其间充质中有少量散在的棕黄色存在；E14.5，对照组两侧腭突上提，在舌体上方呈水平相对，中线区可见一条棕黄色的上皮中缝，同时在口腔侧及鼻腔侧上皮两腭突接触区域呈现三角形棕黄色区域；DEX组两侧腭突相距较远，单侧腭突上皮表面呈现明显的棕黄色，同时观察到腭突间充质中出现散在棕黄色区域。E15.5，对照组两侧腭突完全融合，中缝区未见棕黄色染色，仅在口腔上皮及鼻侧上皮呈现棕黄色；DEX组两侧腭突相对但不融合，腭突间充质中散在棕黄色区域。E17.5，对照组腭突间充质未发现明显棕黄色区域，而DEX组腭突间充质显示有明显的棕黄色染色。

图2 E-cadherin在对照组和DEX组腭突上皮中的表达 SABC × 100Fig 2 E-cadherin expression in palatogenesis of the control and DEX groups SABC × 100

2.4 real-time PCR定量分析

E-cadherin和β-catenin mRNA在对照组和DEX组的表达量见图3。E14.0，DEX组小鼠腭突中的E-cadherin的表达水平约为对照组的2.5倍，β-catenin约为对照组的2.4倍。E14.5，E-cadherin的表达水平明显增加，增至对照组的9.0倍，β-catenin增至对照组的9.2倍。E15.5，E-cadherin的表达下调，但表达量仍约为对照组的1.9倍，β-catenin的表达也下调，但表达量仍为对照组的2.2倍。经统计学分析，E-cadherin及β-catenin在DEX组与对照组表达量的差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图3 β-catenin（上）和E-cadherin（下）mRNA在对照组和DEX组的表达差异Fig 3 The differences of β-catenin (top) and E-cadherin (bottom)expression between the control and DEX groups

3 讨论

哺乳动物腭部发育过程中，腭突上皮细胞与间充质细胞需要相互协调、相互诱导[2]，两侧腭突垂直生长、上抬、接触、融合形成腭，在此过程中任何干扰因素都有可能影响其正常发育而导致腭裂。在正常腭发育过程中，当两侧腭突接触后，腭突上皮细胞E-cadherin的表达受到抑制，腭突上皮细胞E-cadherin表达减少，导致MES裂解并形成上皮岛，最终完成腭突的融合[1]。本研究发现，经过DEX处理后，两侧腭突体积明显缩小，腭突上抬延缓，导致两侧腭突不能接触融合，进一步验证了本课题组之前的研究[3-4]结果。本实验还发现E-cadherin在腭突间充质中异位表达。E-cadherin是一种依赖于钙离子的细胞间黏附分子，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，几乎表达于所有上皮组织，是一种重要的细胞黏附分子和信号转导分子，对于胚胎发育和细胞转归过程等具有重要作用[5-6]。E-cadherin能够促进细胞间的连接，维持细胞骨架和连接支架的稳定，许多转录因子如Snail、Slug、E12/E47、Sip-1（smad-interacting protein 1）、Zeb-1（zinc finger E-box binding homeobox 1）和Twist可通过直接或者间接抑制E-cadherin的表达导致上皮间充质转化[7]。β-catenin与E-cadherin在细胞膜内表面结合形成E-cadherin/β-catenin复合体，可以维持细胞间黏附并调控β-catenin在细胞质中的表达水平[8]。有学者发现，小鼠Zeb-1基因的变异会导致腭裂发生，并且在腭胚突的间充质细胞中出现了E-cadherin的异位表达以及间充质细胞增殖能力降低[9]。这提示E-cadherin的异位表达与Zeb-1变异小鼠的腭裂表型可能具有一定的相关性。本研究通过 real-time RCR定量分析发现，虽然DEX可致胎鼠形成短小腭突，但是腭突中E-cadherin与β-catenin在腭突上皮与间充质中的表达量比对照组明显增多，由此推测腭裂可能的形成机制是：DEX的作用导致E-cadherin在腭突间充质中异位表达，使腭突间充质黏附性增加，不利于间充质的增殖生长，从而形成短小腭突，最终导致腭裂的形成。

[1]Nawshad A, Medici D, Liu CC, et al. TGFbeta3 inhibits E-cadherin gene expression in palate medial-edge epithelial cells through a Smad2-Smad4-LEF1 transcription complex[J]. J Cell Sci, 2007, 120(Pt 9):1646-1653.

[2]Baroni T, Carinci P, Bellucci C, et al. Cross-talk between interleukin-6 and transforming growth factor-beta3 regulates extracellular matrix production by human fibroblasts from subjects with non-syndromic cleft lip and palate[J]. J Periodontol, 2003, 74(10):1447-1453.

[3]何苇, 卢胜军, 李承浩, 等. 地塞米松和维生素B12对小鼠胚胎腭突发育早期成纤维生长因子10及其2b受体信号的影响[J]. 华西口腔医学杂志, 2010, 28(5):551-555.

[4]何苇, 李承浩, 卢胜军, 等. 地塞米松和维生素B12交互作用对小鼠腭胚突超微结构影响的观察[J]. 口腔医学研究,2009, 25(1):8-11.

[5]Takeichi M. Cadherins: key molecules for selective cellcell adhesion[J]. IARC Sci Publ, 1988(92):76-79.

[6]Hay ED. An overview of epithelio-mesenchymal transformation[J]. Acta Anat: Basel, 1995, 154(1):8-20.

[7]Peinado H, Portillo F, Cano A. Transcriptional regulation of cadherins during development and carcinogenesis[J]. Int J Dev Biol, 2004, 48(5/6):365-375.

[8]Pelosi G, Scarpa A, Puppa G, et al. Alteration of the E-cadherin/beta-catenin cell adhesion system is common in pulmonary neuroendocrine tumors and is an independent predictor of lymph node metastasis in atypical carcinoids[J].Cancer, 2005, 103(6):1154-1164.

[9]Liu Y, El-Naggar S, Darling DS, et al. Zeb1 links epithelialmesenchymal transition and cellular senescence[J]. Development, 2008, 135(3):579-588.