七彩红竹IhCCR-1基因的克隆与分析*



七彩红竹IhCCR-1基因的克隆与分析*

缪福俊1,2，原晓龙1,2，陈剑1,2，杨宇明1,2，王娟1,2

(1.云南省林业科学院，云南昆明650201；2.国家林业局重点开放性实验室云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室；

云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南昆明650201)

摘要：肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase，CCR)是苯丙烷类代谢途径中的关键酶，在七彩红竹木质素和花青素合成代谢流向中起重要作用。依据七彩红竹转录组数据设计特异引物，采用反转录PCR技术从七彩红竹中克隆得到一个新的CCR基因的全长cDNA序列，命名为IhCCR-1(登录号：KP271440)。结果表明，该基因全长cDNA为1 038 bp，编码345个氨基酸的蛋白质，属于酸性稳定蛋白，不存在信号肽，为非分泌蛋白；IhCCR-1蛋白具有保守的KNWYCYGK催化位点，属于NADB-Rossmann超家族，相对分子量为37.61 kDa；IhCCR-1与其他植物的CCR具有较高的亲缘关系。研究结果将为进一步研究七彩红竹木质素产生的分子机理和综合开发利用奠定基础。

关键词：七彩红竹；木质素；花青素；肉桂酰辅酶A还原酶基因；克隆；基因分析

七彩红竹(Indosasahispidacv.Rainbow)是蒲竹仔植物的变种，可产花色素苷[1～2]。因富含花色素苷，具有抗衰老、防辐射、增强免疫力等保健功能，具有重要的观赏价值和潜在的商业开发价值[3～5]。七彩红竹的二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)属非Asn/Asp型，其编码的第134位氨基酸碱基发生突变诱发花色素苷的大量合成，从而导致了浦竹仔产生红色秆的个体[6]。竹子为多年生木质化植物，生长快，易繁殖，是造纸工业的重要原材料，但其木质素严重影响了竹浆品质，增加造纸成本，同时造成了严重的环境污染[7]。然而，木质素和花色素苷的合成同属苯丙烷类代谢途径的两个分支[8-9]。花色素苷与木质素生物合成代谢网络的两个重要调控节点分别是DFR和CCR，二者都以苯丙氨酸为前体，其CCR基因的表达直接影响着苯丙氨酸代谢流的底物转化走向和下游代谢的行进[10～11]。目前，CCR基因已在多种植物中(玉米Zeamays、丹参Salviamiltiorrhiaz、竹子Pleioblastusmaculosoides等)发现[10]。宋恩慧等人和Rest等人通过CCR基因的控制表达，改变木质素代谢途径，使其向纤维素和花色素苷代谢流行进[12～13]。如果能将产花色素苷的DFR基因转入巨龙竹(Dendrocalamussinicus)中，进一步干涉其CCR基因的表达，让巨龙竹产大量的花色素苷，即可提取花色素苷又可降低木质素含量，或成为一种竹类调控代谢途径产物积累量的新思路。目前巨龙竹主要用于造纸用途，因含大量的木质素而严重影响造纸品质，同时对环境造成了污染。故本研究对七彩红竹CCR基因进行克隆与分析，为深入研究七彩红竹花色素苷和木质素代谢途径相关基因功能提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

七彩红竹采自云南省林业科学院温室棚(引自云南普洱地区)，采集幼嫩竹秆，经液氮速冻后于-80℃保存备用。

1.2方法

1.2.1CCR基因的克隆

RNA提取：按RNA提取试剂盒(TIANGEN公司)说明操作。

cDNA合成：按cDNA Synthesis Kit试剂盒(TAKARA公司)说明操作。

CCR基因克隆：引物(由上海生工公司合成)：根据课题组前期转录组数据设计引物(上游引物F：5’-ATGACCGTCGTCGACGTCGCT-3’；下游引物R：5’-TCATGCCGTCACACCGTTCAGTTC-3')。反应体系为25 μL(cDNA：1 μL；F：1 μL；F：1 μL；PrimeSTAR MAX DNA Premix(2×)：12.5 μL；ddh20：9.5 μL)；反应条件(98℃：10 s；55℃：5 s；72℃：10 s)30 Cycles。用DNA回收试剂盒(上海生工公司)切胶回收扩增产物后，连接载体转入感受态细胞，用菌液PCR法鉴定阳性克隆，送上海生工公司测序。

1.2.2CCR基因序列分析

对获得的CCR基因序列进行生物信息学分析[6]，结构功能域为NCBI(http://www.ncbi.nih.gov)中Conserved Domain Database数据库搜索；理化性质预测为ProtParam(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)；聚类树构建为MEGA 3.0软件；信号肽预测为SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；亚细胞定位为WoLF PSORT(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)；三维结构预测为SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)；拉氏图构建为PROCHECK(http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/)。

2结果与分析

2.1IhCCR-1基因的克隆和序列分析

七彩红竹IhCCR-1基因全长的扩增结果如图1-A所示，阳性克隆检测结果如图1-B所示。在NCBI核酸数据库中注册，GenBank登录号为KP271440。经测序IhCCR-1全长cDNA为1038 bp。生物信息学预测该基因能编码一个长345个氨基酸残基的蛋白质(图2)。IhCCR-1蛋白的相对分子量为37.61 kDa，化学方程式为C1666H2637N461O504S13，脂肪系数为93.51，为稳定的酸性蛋白(等电点：5.52；半衰期：30 h；不稳定参数：31.22)。该蛋白不存在信号肽，为非分泌蛋白，可能在细胞质中合成，不进行蛋白转运。亚细胞定位表明该蛋白在细胞质中合成。

AB

图1IhCCR-1基因克隆相关电泳图

注：A为IhCCR-1反转录-PCR电泳图，B为阳性克隆电泳图

Fig.1The related electrophoretograms ofIhCCR-1 gene cloning

图2　IhCCR-1基因cDNA全长及推测的氨基酸序列

2.2蛋白序列结构域分析

IhCCR-1蛋白预测显示由41.16 %的A螺旋、43.48 %的不规则卷曲和15.36 %的延伸链组成。该蛋白具有PLN02214保守结构(图3)，属于NADB-Rossmann超家族。

IhCCR-1具有典型的保守序列KNWYCYGK(图4)，为该蛋白的催化位点。目前的研究表明，KNWYCYGK序列是植物CCR蛋白的催化位点[10]。

图3　IhCCR-1结构域预测

图4　IhCCR-1和其他物种CCR部份氨基酸序列比对结果

2.3IhCCR-1编码蛋白的三级结构预测

IhCCR-1蛋白质的三级结构构象呈现致密球状结构(图5-A)，主要由9条B折叠、12个大小不等的A螺旋和一些不规则卷曲组成。同源建模结果显示，该蛋白质残基的二面角位于黄色核心区域(图5-B)，表明其空间结构稳定，建模结果可靠。

AB

图5IhCCR-1蛋白三维结构模型预测(A)和拉氏构象图(B)

注：红色为α-螺旋；黄色为β-折叠延伸链；绿色为无规卷曲

Fig.5The prediction of tertiary structure (A)and Ramachandram plot prediction (B) of IhCCR-1 protein

2.4IhCCR-1编码氨基酸同源比对分析

经NCBI数据库中Blastp后，选取10个物种构建聚类树。不同物种CCR氨基酸序列的聚类树见图6所示，IhCCR-1基因编码的氨基酸序列与其他植物中CCR具有99 %的相似性。

图6CCR氨基酸序列的同源性分析

注： 基于Neighbor-Joining方法构建，各节点处数字表示boorstrap值，重复1 000次，小数点表示Branch Length值，

不同物种CCR氨基酸序列聚类图(标尺上的数字代表相似性)

Fig.6The homology analysis of CCR amino acid sequence

3结论与讨论

3.1结论

本研究采用反转录PCR从七彩红竹中克隆获得木质素合成途径中的关键CCR基因，命名为IhCCR-1(登录号KP271440)。该基因全长cDNA为1 038 bp，编码345个氨基酸的蛋白质，属于酸性稳定蛋白；IhCCR-1蛋白具有保守的催化位点，相对分子量为37.61 kDa。

3.2讨论

本研究获得的IhCCR-1基因，其生物信息学分析显示该蛋白属于NADB-Rossmann超家族，与其他植物中CCR具有很高的同源性。IhCCR-1具有保守的KNWYCYGK催化位点，是植物CCR蛋白的保守序列。该保守的催化位点(KNWYCYGK)在有些植物中发生了变异，如玉米ZmCCR-1的保守序列为RNWYCYGK，丹参SmCCR-2的保守序列为KNWYCYSK，这些变异可能与CCR催化形成木质素的种类和含量不同有关[10]。IhCCR-1蛋白不存在信号肽，为非分泌蛋白，可能在细胞质中合成，不进行蛋白转运。亚细胞定位表明该蛋白在细胞质中合成，研究结果与已报道的CCR一致[14]。

七彩红竹是浦竹仔的变种，可以产花色素苷，这在竹类中还是首次报道发现，已克隆的InDFR-1基因分析表明，是由第134位氨基酸的碱基发生突变[6]，进而改变苯丙氨酸代谢流向，合成大量的花色素苷，但在其合成过程中，其旁路途径中CCR基因的表达与否还有待后期进一步的研究。目前的相关研究表明通过改变CCR的活性影响木质素的含量培育出新性状转基因植物，以及研究其与细胞壁的生成、抗病、抗逆等抗性方面的关系，这些为今后的深入研究其木质素和花色素苷代谢途径的耦合关系提供理论依据。

参考文献：

[1]徐永椿.云南树木图志(下册)[M].昆明：云南科技出版社，1991.

[2]McClure F A.IndosasahispidaMcClure[J].Lingnan University SciBull，1940，9(1):9-28．

[3]卢钰，董现义，杜景平，等.花色苷研究进展[J].山东农业大学学报，2004，35(2):315-320．

[4]张龙，李卫华，姜淑梅，等.花色素苷生物合成与分子调控研究进展[J].园艺学报，2008，35(6):909-916.

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Cloning Analysis of a Cinnamoyl-CoA Reductase Gene from

Indosasa hispida cv.Rainbow

MIAO Fu-jun1，2，YUAN Xiao-long1，2，CHEN Jian1，2，YANG Yu-ming1，2，WANG juan1，2

(1.Yunnan Academy of Forestry, Kunming Yunnan 650201, P.R.China;2.Key Laboratory for Conservation of Rare,Endangered &

Endemic Forest Plants,State Forestry Administration,Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and

Exploitation of Forest Plants,Kunming Yunnan 650201,P.R.China)

Abstract:Cinnamoyl-CoA reductase (CCR) is a key enzyme in the phenylpropanoid pathway, and plays a critical role in metabolic flow of lignin and anthocyanin.In this study,we cloned the full-length of cDNA of a novel CCR gene from Indosasa hispida cv.Rainbow with the method of reverse transcription PCR and gene-specific primers using a semi-quantitative RT-PCR technique according to the transcriptome sequencing data.This novel gene was named as IhCCR-1(Accession Number：KP271440).It has a length of 1 038 bp and encoded with a protein of 345 amino acids.The IhCCR-1 protein is a stable acidic and non-secretory protein that has no signalpeptide.The IhCCR-1 protein belonged to the NADB-Rossmann superfamily and contained the conserved KNWYCYGK motif.IhCCR-1 is closely related to the other plants.The results above would lay a theoretical basis for further exploration of molecular mechanism of lignin and for the comprehensive exploitation and utilization of Indosasa hispida cv.Rainbow.

Key words:Indosasa hispida cv.Rainbow; lignin; anthocyanins; Cinnamoyl-CoA reductase；clone; gene analysis

中图分类号：S 792.15

文献标识码：A

文章编号：1672-8246(2015)05-0057-06

通讯作者简介：王娟(1966-)，女，教授，博士，主要从事生物多样性保护和竹类植物研究。E-mail：schima@163.com

作者简介：第一缪福俊(1986-)，男，研究实习员，硕士，主要从事植物分子和微生物学研究。E-mail：miaofujun@yeah.net

基金项目：云南省基础研究重点项目(2013FA054),云南省自然科学基金(2009CD073),云南省中青年学术技术带头人后备人才 培养项目(2010CI016),国家林业局948项目(2008-4-30)。

收稿日期：*2015-04-15

doi10.16473/j.cnki.xblykx1972.2015.05.011