耐酸植物乳杆菌的紫外诱变选育及性质的研究

尹义敏，田丰伟，翟齐啸，王刚，张秋香，张灏，陈卫，2

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）

0 引言

乳酸菌是能够利用糖类发酵产乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称，包括乳杆菌、乳球菌和双歧杆菌等至少23个属[1]。广泛应用于医药、食品和饲料等行业中，被公认为是安全的食品级微生物[2]。乳酸菌能维持肠道平衡[3]、降低血清胆固醇[4-6]、增强免疫能力[7]等。

乳酸菌发酵不断积累的乳酸，以及胃酸环境严重影响其生理活性。因此，耐酸性被认为是益生乳酸菌筛选过程中重要的因素之一[8]。近年来，适应性进化和定向进化被广泛应用于极端微生物的筛选，并且成功选育一些耐极端环境的微生物，但周期相对较长[9-12]。所以，传统的诱变育种筛选菌株仍是不错的选择。

本实验对Lactobacillus planturam CCFM8661进行紫外诱变，通过低pH MRS培养基筛选出两株耐酸能力提高且性能较稳定的诱变菌株。

1 实验

1.1 菌株与培养基

实验所用菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus planta⁃rum CCFM8661），为江南大学食品学院生物技术中心实验室自行分离。在MRS培养基中培养，培养条件为37℃(24 h)。筛选培养基为pH值为3.5和3.0的MRS培养基（用浓度为1 mol/L的HCl调节）。

1.2 方法

1.2.1 实验流程

菌种活化→初始菌株生长曲线的测定→菌悬液的制备→紫外诱变处理→耐酸突变株的初筛→耐酸突变株的复筛→突变株耐酸能力的分析→遗传稳定性的测定

1.2.2 生长曲线的测定

将活化的菌株以2%的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养，每隔2 h取样测定

OD600值，以空白MRS培养基为对照。以时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制初始菌株的生长曲线。

1.3 菌悬液的制备

将活化初始菌株以2%接种量接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养至对数生长期中后期。取出10 mL菌液，在6 000 r/min下离心10 min，弃掉上清液，收集菌体。然后用浓度为0.1 mol/L pH值为7.0磷酸缓冲液（PBS）洗涤3次，主要是将残留的培养基洗净。将细胞重新悬浮在PBS缓冲液中，将细胞浓度调节到108mL-l，制成菌悬液。最后加入玻璃株振荡分散10 min，用无菌脱脂棉过滤，使形成单细胞，分散程度达90%～95%。

1.4 紫外诱变处理

取制备好的菌悬液5 mL于直径9 cm的无菌平皿中，在其中加入转子。紫外灯打开预热30 min，以稳定光波。将盛有菌悬液的平皿放置磁力搅拌器上，放到离功率为15W的紫外灯30 cm处，开启磁力搅拌器，打开平皿盖，暴露紫外光下照射一定时间，边搅拌边照射，力求使细胞均匀吸收紫外线光波。使用秒表计时，分别照射15，30，45，60，75，90 s。以上照射过程是在有红光的暗室内进行，以免光修复。

1.5 菌株致死率的测定

分别取经过UV照射处理的菌液与未照射处理的（作为空白对照）菌悬液1 mL进行梯度稀释。取0.1 mL稀释液在MRS固体培养基上涂匀，将平板用黑布包好，倒置于37℃恒温培养箱中培养24 h，待平板上长出菌落进行计数计算致死率[13]。实验三次平行，取平均值。

致死率为

致死率=（A-B）/A×100%，

式中：A为未经照射处理菌体长出的菌落数；B为紫外照射处理菌体长出的菌落数。

1.6 耐酸突变株的筛选

挑选形状规则的诱变后单菌落移至MRS液体培养基上，并置于37℃，培养24 h。再以2%接种量分别接种于含200 μL pH3.5 MRS培养基的96孔板中，继续培养24 h后，使用酶标仪测得OD600，计算相对生长率。将初筛得到相对生长率明显高于出发菌株的菌体挑选出来，以2%接种量转接到含200 μL pH3.0 MRS培养基的96孔板中，37℃下培养24 h，用酶标仪测得OD600，计算相对生长率[14]，即相对生长率=（d-b-c）/（a-b-c）× 100%，

式中：a为测定的菌株在pH=6.3的培养基中生长的吸光值；b为测得的空白培养基的吸光值；c为计算得接种时的吸光值（10%接种量×菌株活化后的吸光值）；d为测定的菌株在pH=3.5培养基中生长的吸光值。

1.7 遗传稳定性分析

将上述实验得到的突变株在MRS液体培养基中连续传代10次，将每一代都接种到pH值为3.0的MRS液体培养基中，37℃培养24 h。取每次传代菌株的菌液测定其OD600，计算相对生长率。每代重复三次，观察其遗传稳定性。

1.8 突变株的耐酸性能分析

为了比较突变株与原始菌株在pH值为3.5条件下的生长情况，将正突变株与出发菌株分别接种到pH值为3.5的MRS液体培养基中，37℃下培养24 h。然后梯度稀释，测定活菌数。

将突变株与原始菌株接种到pH值为3.0的MRS液体培养基中，胁迫不同时间，梯度稀释涂在MRS平板上测定活菌数和存活率来比较分析存活能力。

2 结果与分析

2.1 L.plantarum CCFM8661的生长曲线

为了保证诱变处理时细胞具有一定的浓度从而可以增加细胞变异数，选择对数生长中后期的细胞进行诱变处理。生长曲线如图1所示。

由图1可以看出，L.plantarum CCFM8661的对数期在4～14 h，之后菌液浓度基本保持不变，因此选用12 h的菌体制备菌悬液进行紫外诱变处理。

图1 L.plantarum CCFM8661的生长曲线

2.2 紫外诱变剂量的确定

用于微生物诱变的紫外线剂量的表示方法，可分绝对剂量和相对剂量。绝对剂量需要用一种剂量仪来测定，由于操作困难，不常被采用。常采用紫外线的致死率来表示相对剂量。

根据文献报道[12]，一般认为诱变后菌体的致死率在90%～95%效果较好，更容易筛选出变异幅度较大的突变菌株。因此本文以此为依据确定最佳诱变剂量。

以照射时间为横坐标，致死率（%）为纵坐标绘制L.plantarum CCFM8661的致死率曲线，如图2所示。

图2 L.plantarum CCFM8661的致死率曲线

由图2可以看出，随着紫外线照射时间的延长，致死率逐渐上升。当照射15 s时，致死率为65.27%。当照射30 s时，致死率达到90.30%，之后致死率趋于平缓。按照菌体致死率大约在90%～95%之间的诱变剂量来观察其正突变率。因此，本研究采取照射时间为30 s，致死率为90.30%。

2.3 耐酸突变株的筛选

对L.plantarum CCFM8661紫外诱变30 s，从诱变后的突变菌株中挑取107个菌落进行筛选，分别编号为V-1到V-107，在pH3.5的MRS液体培养基中初筛得到13株相对生长率明显高于原始菌株，然后在pH3.0的MRS液体培养基进行复筛。13株菌的相对生长率具体数据结果如表1所示。表1中数据为三组平行的平均值。

表1 菌株在不同pH值的培养基中的相对生长率

由表1可以看出，经过初步筛选，有13株突变菌株在pH值为3.5的MRS液体培养基中相对生长率明显高于原始菌株；经过pH值为3.0的培养基进行复筛，其相对生长率提高幅度不大，仅有两株突变株相对生长率大于6%。其中，V-30在pH值为3.5的相对生长率由39.83%提高到49.67%，V-48相对生长率由39.83%提高到51.18%；V-30在pH值为3.0的相对生长率由3.30%提高到7.30%，V-48相对生长率由3.30%提高到6.96%。所以由此可判断V-30与V-48较原始菌株更能耐受pH值为3.5与pH值为3.0的酸环境。即V-30与V-48作为下面实验研究的目标突变株。

2.4 突变株遗传稳定性的分析

L.plantarumCCFM8661的突变菌株V-30和V-48遗传稳定性的测定结果如图3所示。

由图3可以得出，在pH值为3.0的条件下突变株V-30和V-48每传一代的相对生长率都比较稳定，没有出现原位回复突变的情况，由此可以说明诱变菌株的遗传稳定性较好。

2.5 突变株的耐酸能力比较分析

为了分析突变菌株的耐酸性质，将原始菌株与突变株在pH值为3.5条件培养测定活菌数，在pH值为3.0条件下分别培养2，4和6 h测定存活率，结果如图4所示。图4中，V-30与V-48的活菌数明显高于原始菌株，分别是原始菌株的2.06和2.46倍。不同字母代表的组别间具有显著性差异（P＜0.05）。

图3 遗传稳定性测定结果

图4 突变菌株在pH3.5的MRS液体培养基中的生长能力

由图4可以看出，在pH值为3.5的MRS中培养24 h后，V-30与V-48的活菌数明显高于原始菌株，分别是原始菌株的2.06和2.46倍。

图5 突变株在pH=3.0 MRS培养基中的存活率

图5为突变菌株V-30、V-48和原始菌株L.plan⁃tarumCCFM8661对盐酸胁迫的耐受性。由图4可以看出，随着盐酸胁迫时间的延长，原始菌株与突变菌株的存活率都存在不同程度的下降，当胁迫6 h后，原始菌株存活率为44%，而突变株V-30存活率为74.58%，V-48存活率为76.74%，分别提高了30.58%和32.74%。

3 讨论

乳酸菌作为益生菌，发挥其益生作用必须达到一定的活菌数。然而，外部的酸胁迫环境与人体内胃酸溶液都严重地影响了它的生理特性。因此，提高乳酸菌的酸耐受性是非常有必要的。而紫外诱变作为一种传统的诱变育种方法，条件简单、易于操作，在筛选耐极端环境的乳酸菌也有成功的报道。

本研究选择L.plantarum CCFM8661作为出发菌株，通过紫外诱变的方法来提高耐酸能力。结果表明，经过紫外诱变得到的两株突变株V-30与V-48在pH值为3.5和3.0的相对生长率均有所提高，且在pH值为3.0条件下存活能力也明显增强。表明紫外诱变对植物乳杆菌提高耐酸性是有效果的，为进一步研究耐酸机制奠定了基础。

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