混菌发酵奶牛精饲料的研究

刘向敏， 齐景伟*， 安晓萍， 刘 娜， 罗旭光， 陈大勇

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古斯隆生物技术有限责任公司，内蒙古呼和浩特011517；3.内蒙古赛诺草原羊业有限公司，内蒙古呼和浩特 010011）

近年来，微生物发酵技术被广泛应用在饲料工业中，饲料经发酵后，不仅适口性增强，难于消化的营养物质、抗营养因子和毒素含量降低，而且还可以提高蛋白质含量，为动物提供有益微生物及其代谢产物，以调节动物胃肠道的微生态平衡和提高动物机体的免疫力（陶蕾等，2015；洪峰等，2014）。 用于发酵饲料的菌种主要有乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和霉菌（李龙，2010；李永凯等，2009）。

本试验采用枯草芽孢杆菌与酵母菌混合发酵，以真蛋白质为评价指标，从菌种的接种比例、腐植酸钠添加量、麸皮含量、接种量、含水量等方面对奶牛精饲料发酵进行了研究，为奶牛精饲料的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 枯草芽孢杆菌与酵母菌由内蒙古斯隆生物技术有限责任公司保存与提供。

1.1.2 原料 奶牛精饲料、麸皮和腐植酸钠均从市场购买。

1.1.3 培养基 营养肉汤（1 L）：蛋白胨 10 g，牛肉膏粉 3 g，氯化钠 5 g。麦芽汁培养基（1 L）：麦牙膏粉130 g，氯霉素0.1 g。以上两种培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司。配制固体培养基时，需加入2%的琼脂粉。

固态发酵培养基为奶牛精饲料、麸皮。奶牛精饲料组成如下：玉米蛋白28.65%，豆粕5%，菜籽粕 5%，棉籽粕 7%，DDGS14.5%，盐 0.8%，苏打1%，石粉1.7%，尿素0.6%，预混料0.2%，氧化镁0.15%，氢钙0.4%，玉米35%。

1.1.4 仪器 可见光分光光度计、离心机、水浴锅、恒温培养箱等。

1.1.5 主要试剂 福林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成。A液：4%碳酸钠溶液与0.2 mol/L氢氧化钠溶液等体积混合。B液：1%硫酸铜溶液与2%酒石酸钾钠溶液等体积混合。使用前将A与B按50∶1的比例混合即成，当天配制使用。福林-酚试剂乙液，购买于杭州迪测生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化及种子液的制备 枯草芽孢杆菌：将冷冻保存的菌种划线在灭菌的营养琼脂平皿中，37℃培养箱培养24 h。待长出菌落后，挑取3～4个菌落于灭菌的营养肉汤培养基中，37℃摇床培养24 h，即得种子液。

酵母菌：将冷冻保存的菌种划线在灭菌的麦芽汁琼脂培养基平皿中，28℃培养箱培养24 h。待长出菌落后，挑取3～4个菌落于灭菌的麦芽汁培养基中，28℃摇床培养24 h，即得种子液。

1.2.2 检测指标 待测液的制备：称取0.3 g经65℃烘干并粉碎的饲料样品，加入8 mL蒸馏水，混匀加入2 mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀，50℃恒温水浴锅水浴1 h，4000 r/min离心5 min，取上清液，即为待测液。

真蛋白质测定方法同赵书景（2008）的测定方法。

1.3 数据处理 数据经Excel 2007初步整理后，用 SPSS 17.0中的单因子方差分析 （One-Way ANOVY），以P＜0.05作为差异显著水平判断标准，差异显著时采用Duncan’s方法对各组间平均数进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌与酵母菌的接种比例对饲料真蛋白质含量的影响 枯草芽孢杆菌与酵母菌以不同比例混合发酵奶牛精饲料，饲料中真蛋白质含量见图1。

由图1可以看出，枯草芽孢杆菌与酵母菌以任何比例接种都可增加饲料中真蛋白质的含量，当枯草芽孢杆菌与酵母菌比例为3∶7时，真蛋白质含量为18.66%，与原精料相比提高了3.35%（P＜0.05），故确定枯草芽孢杆菌与酵母菌接种比例为3∶7。枯草芽孢杆菌与酵母菌是微生物发酵技术常用的发酵菌种 （甄玉国，2005；Antonio 等，2004）。酵母菌菌体蛋白含量高，约占菌体干物质的32%～75%，其细胞壁含有多种生物活性物质，能促进免疫反应，具有益生菌和益生元的特点和作用（朱平军，2011）。枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶可将大分子蛋白分解为小分子蛋白、肽类和游离氨基酸。两菌种在饲料发酵过程中发挥不同的作用，不同配比将直接影响饲料的品质，而适当的菌种比例会充分体现两种菌的优势，并促进其共同生长（揣玉多等，2008）。

图1 枯草芽孢杆菌与酵母菌的接种比例对饲料真蛋白质含量的影响

2.2 种子液中不同腐植酸钠添加量对饲料真蛋白质含量的影响 种子液中不同腐植酸钠添加量对饲料中真蛋白质含量的影响见图2。

图2 种子液中不同腐殖酸钠添加量对饲料真蛋白质含量的影响

由图2可以看出，种子液中腐植酸钠添加量为0.5%～2%时，真蛋白质含量随着腐植酸钠的增加而增多；腐植酸钠添加量为2%～8%时，真蛋白质含量随着腐植酸钠的增加而降低，当腐植酸钠添加量为2%时，真蛋白质含量为18.46%，未添加腐植酸钠组真蛋白质含量为17.25%，两者相比，种子液中添加2%的腐植酸钠显著提高1.21个百分点。

2.3 发酵底物中不同腐植酸钠添加量对饲料真蛋白含量的影响 发酵底物中不同腐植酸钠添加量对饲料中真蛋白质的影响见图3。由图3可以看出，发酵底物中添加不同含量的腐植酸钠均可明显提高真蛋白质含量 （P＜0.05），当腐殖酸钠添加量为0.5% ～2%时，真蛋白质含量随着腐植酸钠的增加而增加；腐植酸钠添加量为2%～8%时，真蛋白质含量随着腐植酸钠的增加而降低，当发酵底物中腐植酸钠添加量为2%时，真蛋白质含量可达20.13%，未添加腐植酸钠组真蛋白质含量为18.17%，两者相比，真蛋白质含量显著提高1.96个百分点（P＜0.05）。

图3 发酵底物中不同腐植酸钠添加量对饲料真蛋白质含量的影响

2.4 发酵底物中麸皮添加量对饲料真蛋白质含量的影响 不同的麸皮添加量对饲料中真蛋白质含量的影响见图4。

图4 发酵底物中麸皮含量对饲料真蛋白质含量的影响

由图4可以看出，麸皮添加量为5%～15%时，真蛋白质含量随着麸皮的增加而增加，与未添加麸皮组相比，差异显著；当麸皮添加量为15%～20%，随着麸皮含量的增加，真蛋白质含量逐渐降低。因为5%、10%和15%组真蛋白质含量分别为20.16%、20.21%、20.26%（P＞ 0.05）， 故麸皮最适添加量为5%。麸皮作为一种辅料加入到底物中，不仅可保持发酵基质的疏松性，而且可维持合适的碳氮比，并为菌体提供生长所需的微量元素（汪伦记等，2012）。

2.5 接种量对饲料真蛋白质含量的影响 合适的接种量可有效促进菌体的生长并分泌代谢物，减少发酵成本。不同接种量对饲料中真蛋白质含量的影响见图5。

图5 接种量对饲料真蛋白质含量的影响

由图5可以看出，在总接菌量较小的情况下，菌种需要较长时间才能大量生长，对固态物料利用率低。接种量为2.5%～7.5%，真蛋白质含量随着接种量的增加而增加；接种量为7.5%～10%，真蛋白质含量随着接种量的增加而降低。可能是由于接菌量过大，饲料中的水分、营养成分满足不了菌体的正常代谢，抑制了菌体生长；菌体生长旺盛，固态发酵饲料温度过高，从而影响菌体生长。又因为2.5%、5%和7.5%组真蛋白质含量分别为20.25%、20.35%、20.45%（P＞ 0.05）， 故确定最佳接种量为2.5%。

2.6 含水量对饲料真蛋白质含量的影响 含水量低，使菌体生长受到抑制；含水量过高，发酵料就会过湿过黏，对发酵料散热不利，在好氧发酵时影响发酵原料的透气性和氧气浓度。不同的含水量对饲料中真蛋白质含量的影响见图6。

图6 含水量对饲料真蛋白质含量的影响

由图6可以看出，含水量为40%～50%时，真蛋白质含量随着水分的增多而增多，含水量为50%时，真蛋白质含量可达20.26%，显著高于前三组（P＜0.05）；含水量为50% ～60%时，真蛋白质含量随着水分的增加而降低，原因可能是过多的游离水分影响了氧气在物料中的传递，使菌体缺氧，影响生长。由此可以得出，最适含水量为50%。

2.7 发酵时间对饲料真蛋白质含量的影响 发酵时间对饲料真蛋白质含量的影响见图7。

图7 发酵时间对饲料真蛋白质含量的影响

由图7可以看出，随着发酵时间的增加，真蛋白质含量也相应增加。发酵早期，菌体对新的生长环境适应较差，生长缓慢，代谢能力差，因此真蛋白质含量较低，当发酵时间为 12、24、36、72 h，真蛋白质含量差异不显著（P＞0.05）。随着发酵时间的延长，菌体数量增多，代谢增强，真蛋白质含量逐渐增高，在48 h时达到最大，为20.16%。与发酵时间为60 h时差异不显著（P>0.05），与其他组相比，差异显著（P＜0.05）。而后，随着发酵时间的延长，真蛋白质含量虽有增加，但增幅很小。故确定最佳发酵时间为48 h。

2.8 发酵温度对饲料真蛋白质含量的影响 发酵温度也是影响微生物发酵的一个重要因素，过高或过低都不利于菌体的生长。不同的发酵温度对饲料中真蛋白质含量的影响见图8。

图8 发酵温度对饲料真蛋白质含量的影响

由图8可以看出，随着温度升高，真蛋白质含量逐渐增加。当温度为34℃和36℃，真蛋白质含量分别为20.11%和20.6%，差异不显著，故确定最佳发酵温度为34℃。当发酵温度为34℃和36℃时，两菌种可较好地共生，菌体生长旺盛，对饲料的利用率更高，菌体蛋白大量产生，较大提高饲料中真蛋白质含量。

3 结论

本试验条件下得到的奶牛精饲料最佳发酵条件为：枯草芽孢杆菌与酵母菌接种比例为3∶7，种子液中腐植酸钠最适添加量为2%，发酵底物中腐植酸钠最适添加量为2%，麸皮含量5%，含水量50%，接种量2.5%，发酵时间48 h，发酵温度34℃。在此条件下，真蛋白质含量可达19.94%，与未发酵组相比显著提高了4.63个百分点。

[1]揣玉多，王德培，张学炜.多菌种联合发酵奶牛精饲料的研究[J].饲料工业，2008，29（18）：47～50.

[2]洪峰，李胜，蒋国滨.谈发酵饲料的生产现状 [J].黑龙江畜牧兽医，2014，14：113～114.

[3]李龙.复合益生菌发酵饲料工艺参数优化及品质评定：[硕士学位论文][D].上海：上海交通大学，2010.

[4]李永凯，毛胜勇，朱伟云.益生菌发酵饲料研究及应用现状[J].畜牧与兽医，2009，3：90～93.

[5]陶蕾，周玉岩，赵凤舞，等.微生物发酵饲料在畜禽养殖中的发展现状及应用[J].安徽农业科学，2015，13：167～169.

[6]汪伦记，吉艳青，纠敏，等.多菌种固态发酵菊芋糟渣生产蛋白饲料的研究[J].饲料研究，2012，2：77～80.

[7]赵书景.粮食、饲料中蛋白质含量测定方法的研究：[硕士学位论文][D].扬州：扬州大学，2008.

[8]甄玉国.饲用微生态制剂-酵母培养物及其在反当动物中的应用[J].饲料工业，2005，26（1）：5～9.

[9]朱平军.多菌种固态生料仿生发酵豆粕的研究：[硕士学位论文][D].安徽：安徽农业大学，2011.

[10]Antonio M，Jean D，Patrick S，et al.Evaluation of different yeast cell wall mutants and microalgae strains as feed for gnotobiotically grown brine shrimP Artemia franciscana[J].Journal of ExPerimental Marine Biology and Ecology，2004，312（1）：115～136.