高效液相色谱-示差折光法测定饲料中低聚果糖含量

2015-12-16潘城

中国饲料 2015年3期

潘城

（福建省产品质量检验研究院，福建福州 350002）

低聚果糖（FOS）又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖。目前，低聚果糖的测定方法包括分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法以及离子色谱法等。分光光度法和薄层色谱法易产生假阳性且定量误差大，耗时较长；离子色谱法灵敏度较好，但是在电极表面糖类会发生氧化还原反应，从而影响方法的准确性；高效液相色谱法是常用的检测方法，但是，低聚果糖在正常的紫外区和可见光范围内没有吸收，也没有荧光，因此紫外检测器和荧光检测器不适于直接测定这类化合物。蒸发光检测器和示差折光检测器均可以用于低聚果糖的检测，但蒸发光检测器在各大企业实验室还未完全普及，示差折光检测器是检测糖类物质的标准配置，易于普及应用。本实验采用氨基键合相色谱柱与示差检测器联用技术，建立简单、快速、准确的饲料中低聚果糖分离检测技术，为饲料产品中低聚果糖的生产、应用和监管提供有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Waters 2695高效液相色谱仪配2414示差检测器（美国 Waters公司）；DS-8510超声波发生器（上海生析超声仪器有限公司）；Milli Q超纯水制备器（美国Milipor公司）。

乙腈，色谱纯（山东禹王实业有限公司），其他试剂为分析纯。

低聚果糖标准品：蔗果三糖（纯度≥99.0%），蔗果四糖（纯度≥99.0%）、蔗果五糖（纯度≥80.0%），均购于日本和光纯药工业株式会社。

1.2 标准储备液和工作液配制低聚果糖标准储备液的配制：准确称取蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖标准品200 mg，用超纯水溶解并定容至10 mL，配制成浓度为20 mg/mL的标准储备液。

标准工作溶液的配制：将低聚果糖的标准储备液采用逐级稀释的方法配制成浓度0.1～5 mg/mL的系列标准工作液，所有标准储备液和标准工作液均置于0～4℃冰箱中保存。

1.3 样品前处理称取饲料样品5 g于100 mL的烧杯中，加入25 mL超纯水，于超声波振荡器中超声萃取20 min后，转移至50 mL容量瓶中，加入200 g/L乙酸锌溶液和100 g/L亚铁氰化钾溶液各1 mL沉淀蛋白，超纯水定容至刻度。提取液经10000 r/min离心5 min后，取上清液，以0.45 μm滤膜过滤，滤液供分析用。

1.4 色谱条件色谱柱：XB-NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国 Welch 公司）；柱温：35 ℃；流动相：乙腈∶水=65∶35（V/V）；流速 1.0 mL/min；进样量10 μL。

1.5 计算方法用外标法分别测定蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的含量，上述三种组分糖含量的总和为样品中低聚果糖的含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化不同糖分子在氨基柱中形成了不同强度的氢键结合力，在分离时具有一定的优势。因此本方法选用氨基柱作为分离色谱柱，同时选择乙腈-水为流动相。实验对比了不同乙腈-水比例对三种低聚果糖保留时间的影响，结果如图 1 所示，采用乙腈-水（65∶35，V/V）进行等度洗脱可得到较好的分离效果。低聚果糖不具有紫外或荧光吸收基团，因此无法采用紫外或荧光检测器进行检测。本方法通过优化色谱条件，选用示差折光检测器可得到较高的灵敏度。

图1 低聚果糖标准溶液、饲料样品和饲料样品加标色谱图

2.2 前处理条件优化糖类具有较好的水溶性，实验结合超声波振荡器可充分萃取样品中的低聚果糖。提取液中的蛋白质等化合物会对测定样品中的低聚果糖产生干扰，实验通过选用乙酸锌和亚铁氰化钾作为沉淀剂，降低了其他化合物对检测准确性的影响。

2.3 线性方程、线性关系、检出限及定量限配制浓度为0.1～5 mg/mL低聚果糖系列标准工作溶液，以低聚果糖的峰面积对浓度进行线性回归，回归参数和最低检测限见表1。结果表明，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖在0.1～5 mg/mL具有很好的线性关系，相关系数R均为1.0000。以3倍信噪比（S/N=3）为检出限，以10倍信噪比（S/N=10）为定量限，则蔗果三糖的检出限为0.03 g/kg，其定量限0.10 g/kg；蔗果四糖的检出限为0.04 g/kg，定量限为0.13 g/kg；蔗果五糖的检出限为0.05 g/kg，定量限为0.15 g/kg。

表1 回归参数和最低检测限

2.4 回收率和精密度在优化后的测定条件下，取饲料样品进行加标回收实验，加标水平分别为24.44、122.2、611.0 g/kg，每个水平重复分析 6 次，结果见表2。从表2可知，该方法的加标回收率为94.1% ～108.1%，相对标准偏差（RSD）为0.8% ～5.1%，结果表明，该方法适用于饲料中低聚果糖的日常分析检测。