吡非尼酮对转化生长因子-β1诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成的影响*

王琳娜，陈常勇，郭存霞，陈小永，陈香美

[1.河南省中医院肾病科，河南 郑州 450002；2.中南大学湘雅医院放射科，湖南 长沙 410008；3.中国人民解放军总医院肾脏病科（肾脏疾病国家重点实验室），北京 100853]

·论著·

吡非尼酮对转化生长因子-β1诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成的影响*

王琳娜1，陈常勇2，郭存霞1，陈小永1，陈香美3

[1.河南省中医院肾病科，河南 郑州 450002；2.中南大学湘雅医院放射科，湖南 长沙 410008；3.中国人民解放军总医院肾脏病科（肾脏疾病国家重点实验室），北京 100853]

目的探讨吡非尼酮（PFD）对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的乳鼠心肌成纤维细胞（CFB）增殖和Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）合成的影响，探讨其抗纤维化作用机制。方法①体外培养CFB，不同浓度（0、100、200、400、800和1 600μg/ml）PFD加入CFB培养液中24、48和72 h，四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测CFB增殖，筛选PFD最佳作用浓度范围和作用时间；②根据以上实验结果，选用400和1 600μg/ml PFD加入CFB培养液中48 h作为观察浓度和干预时间，实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）和Western blot检测PFD对TGF-β1诱导CFB增殖、ColⅠmRNA和ColⅠ表达的影响。结果与对照组比较，400和1 600μg/ ml PFD能显著抑制TGF-β1诱导CFB增殖、ColⅠmRNA和ColⅠ表达，400μg/ml即能起显著抑制作用。结论PFD对CFB增殖和胶原蛋白合成有抑制作用，PFD的抗纤维化作用与其有关。

吡非尼酮；心肌成纤维细胞；尿毒症；Ⅰ型胶原蛋白；转化生长因子-β1

尿毒症心肌间质纤维化（uremic myocardial fibrosis，UMF）是在慢性肾脏病基础上，并发心肌肥大和心室重塑的主要病理基础，是慢性心功能不全难以逆转的原因之一，是影响终末期肾病和血液透析患者生存率的独立危险因素[1]，因此切实有效的防治措施受到高度关注。心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFB）是构成心肌组织的主要成分，在数量上占心脏细胞总数的70%～80%。病理状态下，CFB增殖活化为心脏肌成纤维细胞，分泌细胞外基质蛋白，引起心脏纤维胶原蛋白积聚、胶原蛋白组成成分改变及空间结构排列紊乱，导致心肌纤维化。因此，抑制CFB的增殖和活化，在阻止甚至逆转心肌间质纤维化过程中起至关重要的作用。转化生长因子-β1（transform growth factor-β1，TGF-β1）是公认的致纤维化因子。吡非尼酮（Pirfenidone，PFD）是一种新型的广谱抗纤维化化合物，PFD的结构是5-甲基-1-苯基2（1氢）-吡啶酮。本实验通过观察PFD对TGF-β1诱导CFB增殖和胶原蛋白分泌的影响，探讨PFD的抗纤维化机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

PFD由中南大学药学院合成，用含10%胎牛血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）配制成终浓度为1 600、800、400、200和100μg/ml PFD，分装后4℃避光保存。DMEM培养基（美国GIBCO公司），胎牛血清（fetal calf serum，FCS）、胰蛋白酶、重组人TGF-β1、四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自美国Sigma公司，酶标仪（美国Bio-Rad公司），Rneasy Mini Kit试剂盒（美国Qiagen公司），逆转录试剂盒（美国Promega公司），SYBR Premix Ex Taq试剂盒（美国Taraka公司）。

1.2 乳鼠CFB原代培养

取出生1～2 d Wistar大鼠，无菌条件下剪取心室肌，剪碎心肌，0.25%胰酶消化后，加入10%胎牛血清培养，调整细胞密度为1×105个/μl，差速贴壁1 h，去除心肌细胞获得成纤维细胞，继续培养细胞至融合状态后按1∶2传代，传代后成纤维细胞以波形蛋白单克隆抗体免疫细胞化学染色鉴定，纯度达到95%用于实验。细胞接种于25 cm2培养瓶中，37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养，每2～3 d更换1次培养基，待细胞长满后，0.25%胰蛋白酶消化，传代。取传2、3代细胞用于实验。

1.3 PFD对CFB增殖的影响

处于对数生长期的细胞接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液200μl，接种密度为1×104个/ml，37℃、5%CO2孵箱中继续培养。待细胞贴壁后弃上清液，加入无血清的DMEM作用24 h，使细胞同步化。设空白对照孔，加入PFD（0、100、200、400、800和1 600μg/ml），每个浓度均重复6孔，37℃、5% CO2孵箱中培养24、48和72 h后，每孔加入MTT 20μl（5 ng/ml）。置孵箱中4 h后取出培养板，弃上清液，每孔加DMSO 150μl。用ELISA自动分析仪490nm处测定各孔光吸收度值（opital density，OD），计算6孔的均数。通过上述实验，筛选出PFD抑制CFB增长的有效浓度范围和最佳作用时间。

1.4 PFD对TGF-β1诱导CFB增殖的影响

处于对数生长期的细胞接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液200μl，接种密度为1×104个/ml，37℃、5%CO2孵箱中继续培养。待细胞贴壁后，弃上清液，加入无血清的DMEM作用24 h，使细胞同步化。加入TGF-β1（5 ng/ml），设空白对照孔，加入PFD（0、400和1 600μg/ml），各浓度均重复6孔。37℃、5%CO2孵箱中培养48 h后，每孔加入MTT 20μl（5 mg/ml）。置孵箱中4 h后取出培养板，弃上清液，每孔加DMSO 150μl。用ELISA自动分析仪490 nm处测定各孔OD值，计算6孔的均数。

1.5 心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的实时定量逆转录-聚合酶链反应检测

1.5.1 细胞总RNA的提取用Rneasy Mini Kit试剂盒提取细胞总RNA，抽提的总RNA用紫外分光光度计测OD值，比值为1.9～2.0。取3μl RNA用1%琼脂糖凝胶电泳，可见28、18和5 S 3条清晰的RNA带，提示RNA无污染和降解。

1.5.2 cDNA的合成用逆转录试剂盒合成cDNA，再以该cDNA为模板进行实时定量逆转录-聚合酶链反应（teal-tima-PCR，RT-PCR）。RT-qPCR的引物序列如下，β-actin正向引物：5'-GGCCAACCGTGA AAAGATGA-3'，反向引物：5'-GACCAGAGGCATAC AGGGACAA-3'；Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠ，ColⅠ）正向引物：5'-TCAGGGGCGAAGGCAACAGT-3'，反向引物：5'-TTGGGATGGAGGGAGTTTACACGA-3'。

1.5.3 RT-qPCR检测按SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）试剂盒说明书进行操作。在ABI 7900型荧光定量PCR仪上进行扩增，96孔板加样，设计复孔和标准曲线。用Sequence Detection System软件分析各检测样本的Ct值（达到一定荧光阈值的循环数），计算2-ΔΔCt，评价ColⅠ在CFB中的表达水平。

1.6 心肌成纤维细胞ColⅠ的Western blot检测

1.6.1 细胞总蛋白质的提取培养细胞弃去上清液，磷酸盐缓冲溶液（phosphate-buffer solution，PBS）洗涤后加入细胞裂解液，裂解30 min。4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液，按Bio-rad蛋白定量试剂盒方法进行蛋白定量，取80μl上清液加20μl 5×变性缓冲液混匀，100℃下变性10 min。

1.6.2 I型胶原蛋白的Western blot检测灌制10%分离胶和4%堆积胶，取总蛋白40μg行上样电泳，电泳结束后260 mA电转印90 min至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）。封闭液（5%牛奶）摇床上封闭2 h，分别加入羊抗ColⅠ多克隆抗体（1∶200），4℃摇床过夜。洗膜后再加羊二抗，室温孵育1 h，加ECL液后显影、定影，以β-actin为内参照。将胶片扫描后，采用Quantity One软件分析各条带灰度值，将各目的条带灰度值除以同一标本内参照β-actin条带灰度值得到比值，将该比值作为ColⅠ蛋白表达量的半定量结果。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PFD对CFB增殖的影响

PFD能抑制CFB增殖，与对照组（PFD 0μg/ml）比较，PFD作用24 h时，1 600μg/ml起效[（0.38± 0.09）vs（0.45±0.05）](t=-2.612，P=0.004）；作用48 h时，PFD 400μg/ml[（0.36±0.03）vs（0.50±0.05）]（t=-4.200，P=0.000），PFD 800 μg/ml[（0.30±0.03）vs（0.50±0.05）]（t=-5.171，P=0.000），PFD 1 600μg/ml [（0.28±0.03）vs（0.50±0.05）]（t=-7.413，P=0.000）起效；作用72 h时，PFD 400μg/ml[（0.62±0.15）vs（0.75±0.12）]（t=-3.507，P=0.002），PFD 800μg/ml [（0.55±0.10）vs（0.72±0.12）]（t=-8.017，P=0.000），PFD 1 600μg/ml[（0.54±0.07）vs（0.72±0.12）]（t=-7.725，P=0.000）起效。根据以上实验，筛选PFD作用的有效浓度范围为400～1 600μg/ml，抑制作用呈剂量依赖性，作用48 h抑制作用最明显。见图1。

图1 不同浓度PFD对CFB增殖的影响（MTT法）

2.2 PFD对TGF-β1诱导CFB增殖的影响（MTT法）

根据上述实验结果，选用PFD400和1600μg/ml为低浓度组和高浓度组，作用时间选择48h。TGF-β1（5 ng/ml）能刺激CFB增殖[（1.68±0.14）vs（1.36± 0.08）]（t=2.373，P=0.003），PFD 400[（1.09±0.12）vs（1.36±0.08）]（t=-1.203，P=0.003）和1 600μg/ml [（0.97±0.17）vs（1.36±0.08）]（t=-4.507，P=0.000）能抑制CFB增殖，高浓度组优于低浓度组[（0.97± 0.17）vs（1.09±0.12）]（t=-1.207，P=0.005）。PFD 400 [（1.1 6±0.17）vs（1.68±0.14）]（t=-5.086，P=0.000）和1600μg/ml[（1.05±0.12）vs（1.68±0.14）]（t=-2.419，P=0.001）能显著抑制TGF-β1（5 ng/ml）诱导CFB增殖，低浓度400μg/ml即能起明显抑制作用，1 600μg/ml的抑制效果强于400μg/ml[（1.05±0.12）vs（1.1 6±0.17）]（t=-1.010，P=0.021）。见图2。

2.3 心肌成纤维细胞ColⅠ的RT-qPCR检测

TGF-β1（5ng/ml）的心肌成纤维细胞ColⅠmRNA表达增加[（2.07±0.44）vs（1.00±0.38）]（t=8.682，P= 0.000），PFD 400[（0.59±0.24）vs（1.00±0.38）]（t =-4.914，P=0.002）和1 600μg/ml[（0.41±0.21）vs（1.00±0.38）]（t=-6.336，P=0.001）能抑制心肌成纤维细胞ColⅠmRNA表达，高浓度组优于低浓度组[（0.41±0.21）vs（0.59±0.24）]（t=-1.580，P=0.050）。同时PFD 400[（0.76±0.36）vs（2.07±0.44）]（t=-9.023，P=0.000）和1 600 μg/ml[（0.64±0.27）vs（2.07±0.44）]（t=-9.988，P=0.000）能显著抑制TGF-β1（5 ng/ml）诱导心肌成纤维细胞ColⅠmRNA表达，高浓度组优于低浓度组细胞ColⅠmRNA表达[（0.64±0.27）vs（0.76±0.36）]（t=-1.523，P=0.402），低浓度400μg/ml即能起明显抑制作用。见图3。

图2不同浓度PFD对TGF-β1诱导CFB增殖的影响（MTT法）

2.4 心肌成纤维细胞ColⅠ的Western blot检测

TGF-β1（5 ng/ml）能刺激心肌成纤维细胞ColⅠ蛋白的表达，PFD 400和1 600μg/ml能抑制心肌成纤维细胞ColⅠ蛋白的表达，高浓度组优于低浓度组。同时PFD 400和1 600μg/ml能显著抑制TGF-β1（5 ng/ml）诱导心肌成纤维细胞ColⅠ蛋白的表达，低浓度400 g/ml即能起明显抑制作用。见图4。

图4 不同浓度PFD对TGF-β1诱导心肌成纤维细胞ColⅠ的检测（Western blot法）

3 讨论

心肌间质纤维化是各种心脏疾病发展为终末期的共同通路，其主要特征是间质成纤维细胞的大量增殖、活化以及成纤维细胞分泌的细胞外基质成分大量沉积[1]。UMF是在慢性肾脏病基础上并发心肌肥大和心室重塑的主要病理基础。随着慢性肾脏病的进展，肾间质纤维化程度逐渐升高，尿毒症患者体内以TGF-β为代表的促纤维化因子逐渐升高。UMF是在除心肌机械压力和容量负荷外，炎症因子及致纤维化因子刺激，代谢毒物的毒性作用及营养物质的缺乏（如白蛋白和某些微量元素）或失衡等综合作用造成的心肌特异性病变。

PFD是新型的吡啶酮类化合物，具有抗肺[2-3]、肝[4-5]、肾[6-7]及皮肤[8-9]纤维化作用，但目前PFD对尿毒症心肌纤维化的研究少有报道。本研究以TGF-β1刺激CFB，建立大鼠尿毒症心肌纤维化细胞模型。本实验发现，0～1 600μg/ml PFD对CFB作用24、48和72h，能抑制CFB增殖。PFD在有效浓度范围内作用时间在24 h时，1 600μg/ml PFD起效；48 h时，400～1600μg/ml PFD即能起到明显的抑制作用，当作用时间延长为72 h时，400、800和1 600μg/ml有效，但作用强度不如48 h，作用强度呈浓度依赖性，未呈时间依赖性。

笔者继续选用400和1 600μg/ml PFD为低浓度组和高浓度组，以48h为干预时间点，观察PFD对TGF-β1诱导CFB增殖和分泌胶原蛋白的影响。研究发现，TGF-β1能刺激CFB增殖、促进ColⅠmRNA和ColⅠ表达，在无TGF-β1刺激的情况下，PFD 400和1 600μg/ml能抑制CFB增殖、抑制ColⅠmRNA和ColⅠ表达；同时PFD 400和1 600μg/ml能显著抑制TGF-β1诱导CFB增殖、ColⅠmRNA和ColⅠ表达，400μg/ml即能起明显抑制作用。文献报道，PFD可成浓度依赖性模式抑制血小板源性生长因子诱导的肝星状细胞增殖，最大浓度为1 875μg/ml[10]。本实验中最大浓度为1 600μg/ml，与该浓度相近，PFD药物浓度再增加时血浆溶解度降低。说明PFD对不同成纤维细胞的作用浓度相似，作为抗纤维化药物，PFD抑制成纤维细胞增殖效果稳定可靠。

AZUMA等[11]在日本进行特发性肺纤维化的Ⅱ期临床实验中，107例特发性肺纤维化患者被随机分为两组，分别接受PFD（72例，1 800 mg/d）和安慰剂（35例）治疗。观察时间为9个月，发现PFD治疗组患者6 min运动实验最低氧饱和度、肺活量下降和急性加重的发病率较安慰剂组明显改善，该研究的PFD剂量为1 800 mg/d。SHARMA等[12]在2011年对PFD治疗糖尿病肾病的研究中发现，通过1年的观察，低剂量组（PFD1200mg/d）较高剂量组（PFD 2 400mg/d）和安慰剂组肾小球滤过率上升3.3～2.2 ml/（min· 1.73 m2），差异有统计学意义。在77例患者中，低剂量组未进入透析，高剂量组1例进入透析，安慰剂组4例进入透析。该两项研究表明，PFD的人体实验最佳参考剂量为1 200～1 800 mg/d，同细胞实验基本一致，中等剂量组作用效果优于高剂量组。

本研究为PFD和类似的吡啶酮类化合物抗纤维化作用机制，以及进一步的细胞、动物和临床实验的研究提供参考。

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（申海菊 编辑）

Effect of Pirfenidone on TGF-β1induced proliferation and collagen synthesis of rat cardiac fibroblasts*

Lin-na WANG1,Chang-yong CHEN2,Cun-xia GUO1, Xiao-yong CHEN1,Xiang-mei CHEN3
[1.Department of Nephrology,Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou,Henan 450002,P.R.China;2.Department of Radiology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,P.R.China;3.Department of Nephrology(State Key Laboratory of Kidney Disease),the General Hospital of Chinese PLA, Beijing,100853,P.R.China]

【Objective】To investigate the effect of Pirfenidone(PFD)on transforming growth factor-β1 (TGF-β1)induced proliferation and typeⅠcollagen(ColⅠ)synthesis in rat cardiac fibroblasts(CFB)and explore its anti-fibrotic mechanism.【Methods】Cardiac fibroblasts were treated with PFD of different concentrations(0,100,200,400,800 and 1,600 μg/ml)for 24,48 and 72 hours.Cell proliferation activity was detected by MTT assay and then the appropriate concentration and time of Pirfenidone were found out. The cultured cardiac fibroblasts were stimulated with TGF-β1and then treated with PFD of different concentrations(400 and 1,600 μg/ml)for 48 hours.Cell proliferation activity was detected by MTT assay,the expression of typeⅠcollagen mRNA was determined by real-time quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction(RT-qPCR)and the amount of typeⅠcollagen in cultured cells was measured byWestern bolt.【Results】Pirfenidone inhibited cardiac fibroblast proliferation stimulated with TGF-β1,the expression of typeⅠcollagen mRNA and the amount of typeⅠcollagen.The effective concentration of Pirfenidone was 400～1,600 μg/ml for 48 h after Pirfenidone was added into culture medium,the concentration of400 μg/mlworkedsignificantly.【Conclusion】Pirfenidonecaninhibitcardiacfibroblastproliferation stimulated with TGF-β1and collagen production which may contribute to its anti-fibrotic mechanism.

Pirfenidone；cardiac fibroblast；uremia；typeⅠcollagen；transforming growth factor-β1

R542.23；R96

A

1005-8982（2015）29-0030-05

2015-02-09

河南省中医药科学研究专项基金（No：2014ZY02021）

王琳娜，现在中国人民解放军总医院肾脏病科暨肾脏疾病国家重点实验室从事博士后研究，Tel：18601268901；E-mail：18925378@qq.com