乳腺癌易感基因1和切除修复交叉互补基因1 mRNA在乳腺癌中的表达及意义*

梁梦，王敏，朱蓓蓓，张会芳，卢仙球

（1.浙江中医药大学附属第三医院，浙江 杭州 310005；2.暨南大学附属第一医院，广东 广州 510632）

·论著·

乳腺癌易感基因1和切除修复交叉互补基因1 mRNA在乳腺癌中的表达及意义*

梁梦1，王敏1，朱蓓蓓2，张会芳1，卢仙球1

（1.浙江中医药大学附属第三医院，浙江 杭州 310005；2.暨南大学附属第一医院，广东 广州 510632）

目的研究乳腺癌易感基因1（BRCA1）和切除修复交叉互补基因1（ERCC1）在乳腺癌发生、发展中的作用及临床意义。方法采用原位杂交技术（ISH）检测BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌癌前病变和乳腺癌组织芯片中的表达，以及与乳腺癌临床病理因素的关系。结果①BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌旁正常组织、乳腺癌癌前病变及乳腺癌组织中的阳性表达率呈递减趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。②BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌的表达差异显著并具有相关性（P＜0.01）。③BRCA1 mRNA的阳性表达与乳腺癌组织学分级、肿瘤大小呈负相关（P＜0.05），与发病年龄、临床分期和淋巴结转移无关（P＞0.05），ERCC1 mRNA的表达与肿瘤大小和淋巴结转移相关（P＜0.05），与患者发病年龄、组织学分级及临床分期无关（P＞0.05）。结论BRCAl与ERCC1 mRNA表达的减少可能与乳腺癌的发生发展有关，两基因的联合检测有利于乳腺癌的早期诊断与治疗。

乳腺癌癌前病变；乳腺癌；乳腺癌易感基因1（BRCA1）；切除修复交叉互补基因1（ERCC1）；原位杂交

近年来，随着乳腺癌发病率的逐年递增，针对其发病机制及治疗方案的探索成为研究热点。许多研究表明，DNA的损伤修复能力在一定程度上决定肿瘤的发生[1]，各种原因所致的DNA修复基因异常突变及甲基化都可引起其功能的失活和表达缺失，导致细胞基因组的不稳定，罹患乳腺癌的风险增大[2-3]。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）和切除修复交叉互补基因1（excision repair cross-complement gene 1，ERCC1）作为DNA损伤修复路径的关键因子，在维系生物体基因组的稳定及组织细胞的生长中起着重要的作用。本研究以高通量、多样本乳腺疾病组织芯片为基础，结合原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）联合检测BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌癌前病变和乳腺癌中的表达，以探讨其在乳腺癌发生、发展中的作用及相互关系，为乳腺癌发病的早期基因筛查及临床诊治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺疾病组织芯片购自陕西超英生物科技有限公司，内含乳腺组织标本芯粒68例。其中患者年龄22～83岁，中位年龄50岁。乳腺癌36例（浸润性导管癌23例，浸润性小叶癌4例，髓样癌3例，黏液癌3例，导管内癌3例），乳腺癌癌前病变22例（乳腺增生性病变13例，不典型增生9例），癌旁远端正常乳腺组织10例。每例点样直径1.5 mm，厚5μm，各点样经病理复阅确诊。上述病例均为散发性女性患者，无乳腺癌家族史，其中36例癌症患者术前均未接受放射及化学治疗。

1.2 方法

试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，为多相寡核苷酸探针，地高辛高敏感标记，BRCA1的序列为：5'-TCTTAGAGTGTCCCATCTGTCTGGAGTTGA-3'；5'-TTCATAGTTGTTCTAGCAGTGAAGAGATAA-3'；5'-AGCCAGATGCCTGGACAGAGGACAATGGCT-3'。ERCC1的序列为：5'-CCTCAGACCTACGCCGAATAT GCCATCTCACAGCC-3'；5'-TTCGTGCGCAATGTGCC CTGGGAATTTGGCGACGT-3'；5'-GCTACCACAACC TCACCCAGACTACATCCATGGG-3'。探针标记及杂交检测程序按试剂盒说明书操作，以试剂盒内配置阳性切片为阳性对照标准，经RNA ase消化1 h后杂交为阴性对照组。杂交液中不加探针结果为阴性。若出现非特异性染色，通过不加探针及阴性样本做对照加以排除。

1.3 结果评定标准

显色后芯粒完整，无掉片组织点，原位杂交阳性信号为胞浆呈棕黄色或棕褐色（见图1）。无明显阳性反应细胞为阴性（-）；阳性细胞＞10%、染色较强者为阳性（+）。

图1 乳腺癌芯片大体图（ISH×40）

1.4统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，样本间比较用χ2检验及Fishers精确检验，两因素相关性用Spearman等级相关分析法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BRCA1 mRNA的表达

原位杂交结果显示，BRCA1的mRNA阳性表达呈棕黄色或棕褐色颗粒分布于细胞浆（见图2）。癌旁正常组织、癌前病变及癌组织的阳性表达率分别为80.0%（8/10）、40.9%（9/22）和16.7%（6/36），3组间阳性表达率呈递减趋势，且表达差异具有相关性，有统计学意义（χ2=14.754，P=0.001）。同癌旁正常组织比较，BRCA1 mRNA在癌前病变及癌组织中的阳性表达率明显下降（χ2=4.219，P＜0.05；χ2=14.827，P＜0.05），而其在乳腺癌癌前病变中的表达亦明显高于乳腺癌中的表达，差异有统计学意义（χ2=4.185b，P＜0.05）。见表1。

2.2 ERCC1 mRNA的表达

经原位杂交检测，ERCC1 mRNA表达信号定位于细胞浆（见图2），其在乳腺癌旁正常组织、癌前病变及癌组织的阳性表达率呈递减趋势，分别为90.0%（9/10）、50.0%（11/22）和22.2%（8/36），3者间阳性表达差异具有相关性，有统计学意义（χ2=15.888，P=0.000）。与癌旁正常组织比较，ERCC1 mRNA在癌前病变及癌组织中的阳性表达率下降明显，有统计学意义（χ2=4.693，P＜0.05；χ2=15.431，P＜0.01），而乳腺良性病变同乳腺癌比较，ERCC1 mRNA阳性表达下降明显，有统计学意义（χ2=4.783，P＜0.05）。见表1。

图2 BRCA1和ERCC1 mRNA的ISH检测（×200）

表1 BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺病变中的表达

2.3 BRCA1与ERCC1 mRNA在乳腺癌中表达的相关性

通过对BRCA1、ERCC1 mRNA表达的相关分析，30例BRCA1 mRNA阴性表达的乳腺癌中，ERCC1 mRNA阳性表达2例，而6例BRCA1 mRNA阳性表达的乳腺癌中，ERCC1 mRNA也同时阳性表达，两者比较差异有统计学意义（P=0.000），相关系数检验两者显著相关（r=0.837，P＜0.01）。见表2。

表2 BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌中表达的相关性例

2.4 BRCA1和ERCC1 mRNA表达与乳腺癌临床病理特征的关系

BRCA1 mRNA的阳性表达与乳腺癌组织学分级和肿瘤大小呈负相关（χ2=4.425，P＜0.05；χ2=6.545，P＜0.05），与患者发病年龄、临床分期和淋巴结转移无关（P＞0.05），ERCC1 mRNA表达与淋巴结转移和肿瘤大小呈负相关（χ2=4.251和8.233，P＜0.05），与患者发病年龄、组织学分级、临床分期无关（P＞0.05）。见表3。

表3 BRCA1和ERCC1 mRNA表达与乳腺癌临床病理特征的关系例（%）

续表3

3 讨论

20世纪90年代，人们通过对早发型乳腺癌和卵巢癌的家族遗传基因谱系分析，发现BRCA1作为一种特异而典型的抑癌基因，在人类乳腺腺管形成、细胞分化及上皮细胞增殖过程中起重要作用[4]。近年来，多数学者认为乳腺癌高危患者有家族遗传性BRCA1基因突变，其杂合性丢失、表达的不稳定性等因素均与乳腺癌的发病密切相关[5-7]，而其在非家族散发性乳腺癌中未发现突变，仅有报道该基因蛋白及mRNA水平在散发性乳腺癌组织中的表达明显下降或失表达并有部分异位表达现象[8-10]。有研究表明，从乳腺上皮增生到癌的发生可能是连续进展的过程，若将癌旁正常组织的基因改变与癌组织进行比较，基本可以反映该基因在乳腺癌发生和进展中的作用[11]。本研究结果显示，与癌旁正常组织比较，BRCA1 mRNA在癌前病变及癌组织的阳性表达率明显下降，且具有等级相关性（P＜0.05），进一步证实BRCA1在乳腺疾病由良性向恶性转变的过程中起重要作用[12]。另有研究显示，该基因的表达与乳腺癌的组织学分级和肿瘤大小呈负相关，提示BRCA1的异常表达与散发型早期乳腺癌的发生、发展和不良预后密切相关[13]。通过对特定人群BRCA1的检测，有利于乳腺癌及其他相关恶性肿瘤的早期诊断与治疗。

ERCC1是一种高度保守的单链DNA核酸内切酶，该基因所编码的297个氨基酸可参与DNA修复系统中的核苷酸切除修复路径修复损伤，以确保基因组的完整性。有关肿瘤发生和发展的学说认为，肿瘤是致癌相关的危险因素暴露造成DNA的损伤，再加上DNA修复基因表达低下，使基因损伤不断地在上皮细胞内累积，导致癌基因和抑癌基因突变等一系列连续事件的发生[14]。当ERCC1表达低下时，其对损伤细胞的修复能力亦减弱，从而使损伤细胞在体内不断积聚，最终导致癌症的发生，因此ERCC1低表达常伴随着癌症发病率的增加，而过表达与化疗耐药有关[15]。本研究发现，同癌旁正常组织相比，ERCC1在癌前病变及癌组织中的阳性表达率下降明显（P＜0.05，P＜0.01），且在肿块较大，有淋巴结转移者中表达率减少，不仅证实ERCC1基因低表达与乳腺癌的发生有关，也提示预后不佳。目前，认为该基因的表达可作为判断肿瘤易感性的一个有价值的生物标志[16]，也为治疗及预后评估提供导向。

综上所述，BRCA1、ERCC1基因作为DNA修复系统中的2个关键因子，在乳腺癌的发生、发展过程中起重要作用且可能具有相关协同性，目前国内对两基因的检测多集中于蛋白表达方面，本研究则侧重于mRNA水平的研究，通过原位杂交技术对两基因进行联合检测。原位杂交技术同其他技术相比具有操作流程简便、可与多种检测方法合并，并易于将mRNA基因活性同组织细胞形态相结合，已较为普遍地为研究者们所应用。本实验研究以期通过两修复基因的表达改变反映乳腺癌的发生、发展过程，为乳腺癌及其他相关恶性肿瘤的高危筛检提供帮助。

[1]王芹,刘强,樊赛军,等.XRCC1基因单核苷酸多态性与肿瘤易感性[J].中国临床医师杂志,2014,8(6):1123-1126.

[2]韦晔,李建祥.DNA修复基因甲基化与肿瘤发生关系的研究进展[J].基础医学与临床,2013,33(4):500-503.

[3]CLARICE P,SILVIA S,ANTONELLA T,et al.Polymorphisms in base excision repair genes:breast cancer risk and individual radiosensitivity[J].World Journal of Clinical Oncology,2014,5(5): 874-882.

[4]任婕,魏敏杰,金锋,等.散发性乳腺癌中影响BRCA1蛋白失表达的参数分析[J].中国肿瘤临床,2008,35(2):99-103.

[5]SIMARD J,DUMONT M,MOISAN AM,et al.Evaluation of BRCA1 and BRCA2 mutation prevalence,risk prediction models and a multistep testing approach in French-Canadian families with high risk of breast and ovarian cancer[J].J Med Genet, 2007,44(2):107-121.

[6]AHN SH,SON BH,YOON KS,et al.BRCA1 and BRCA2 germline mutations in korean breast cancer patient s at high risk of carrying mutations[J].Cancer Lett,2007,245(1/2):90-95.

[7]韦薇,李秋云,唐玮,等.BRCA1基因在散发性乳腺癌中的表达及异常甲基化[J].重庆医学,2015,44(9):1174-1176.

[8]RAKHA EA,EL-SHEIKH SE,KANDIL MA,et al.Expression of BRCA1 protein in breast cancer and its prognostic significance[J]. Hum Pathol,2008,39(6):857-865.

[9]方宏才,张国强,曹传培,等.BRCA1和IGF1R在乳腺良恶性肿瘤中的表达及其意义[J].广东医学,2010,31(1):90-92.

[10]FU YY.The function of BRCA1 gene and its structure features upstream regulation sequence[J].Carcinogenesis Teratogenesis and Mutagenesis,2002,4(1):47-49.

[11]马金柱,张嘉玲,刘明,等.BRCA1与p53在散发性乳腺癌中的表达[J].实用肿瘤杂志,2011,26(3):233-235.

[12]马文浩,韩玉贞,桑晶,等.BRCA1在散发性乳腺癌干细胞中的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志,2012,28(1):19-21.

[13]ZHANG QL,ZHANG QH,CONG H,et al.The ectopic expression of BRCA1 is associated with genesis,progression,and prognosis of breast cancer in young patients[J].Diagn Pathol, 2012,7(1):181.

[14]梁发,谢忠.ERCC1、BRCA1在胃癌中的研究进展[J].齐齐哈尔医学院学报,2011,32(2):262-264.

[15]林肖鹰,陈小岩,黄颖.切除修复交叉互补基因1在乳腺癌中的表达及意义[J].临床肿瘤学杂志,2013,18(12):1096-1099.

（申海菊 编辑）

Expression of BRCA1 and ERCC1 mRNA in breast tumor and its clinical significance*

Meng LIANG1,Min WANG1,Bei-bei ZHU2,Hui-fang ZHANG1,Xian-qiu LU1
(1.The Third Affiliated Hospital,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,Zhejiang 310005,P.R.China;2.The First Affiliated Hospital,Jinan University, Guangzhou,Guangdong 510632,P.R.China)

【Objective】To investigate the role of breast cancer susceptibility gene 1(BRCA1)and excision repair cross-compliment gene 1(ERCC1)in the development and progression of breast cancer and their clinical significance.【Methods】The mRNA levels of BRCA1 and ERCC1 in precancerous lesions and breast cancers were determined by in situ hybridization(ISH)using a tissue microarray,their correlation and clinicopathological factors were determined in 36 cases of breast cancer patients.【Results】①The positive rates of BRCA1 and ERCC1 mRNA in the normal tissues adjacent to breast cancer,the breast precancerous lesions and the breast cancer tissues progressively decreased；their expressions in the three kinds of tissues were significantly different(P＜0.05).②The expressions of BRCA1 and ERCC1 mRNA in the breast cancer were significantly different and correlated(P＜0.01).③The positive expression of BRCA1 mRNA was in negative correlations with the histological grade and tumor size of the breast cancer(P＜0.05),and unrelated to the age of onset,clinical stage or lymph node metastasis.The expression of ERCC1 mRNA was in negative correlations with tumor size and lymph node metastasis(P＜0.05),but not significantly correlative to other clinic pathological features(P＞0.05).【Conclusions】Down-regulation of BRCA1 and ERCC1 mRNA may be corre－lated with development and progression of breast cancer,and combined examination of both genes may be helpful for early diagnosis and treatment of this disease.

breast precancerous lesion；breast cancer；breast cancer susceptibility gene 1；excision repair cross-compliment gene 1；in situ hybridization

R737.9

A

1005-8982（2015）29-0018-05

2015-03-09

浙江中医药大学附属第三医院医药卫生科研计划基金（No：ZS12CA07）