溴结构域蛋白44在肿瘤中的研究进展△

仝营营 丁文评 张莲 金星镜 陈思宇

上海交通大学附属新华医院肿瘤科，上海 200092

溴结构域蛋白4（Brd4）是溴结构域和超末端结构（bromodomain and extraterminal domain，BET）家族成员，其中含有两个溴结构域和一个超末端结构，在整个细胞周期中通过溴结构域结合乙酰化的组蛋白。Brd4通过招募不同的转录调节因子，如Mediator、正性转录延伸因子b（positive transcription elongation factor b，P-TEFb）来调节靶基因的表达。其在调节细胞基因转录、细胞周期、炎症等生物过程中发挥重要作用。另外，最近的研究表明Brd4的表达水平失调或功能紊乱与睾丸核蛋白中线癌（midlinecarcinomawith rearrangement of thenuclear protein in testisgene，NMC）、黑色素瘤、急性髓系白血病、结肠癌、乳腺癌等的发生有关，它参与上皮间质转化、干细胞样转化过程。Brd4 shRNA或BET抑制剂可以诱导上述肿瘤发生细胞周期阻滞、凋亡及细胞分化，显示出强大的抗肿瘤活性。这些发现表明，BET蛋白有望成为上述肿瘤甚至其他肿瘤新的治疗靶点。本文主要阐述Brd4在不同类型肿瘤生物学过程中的作用。

1 BET家族及Brd4

溴结构域蛋白（bromodomains protein）存在于很多核调节因子中，其序列多变，但都携带一个保守的折叠结构，该结构由4个左手α螺旋（αZ、αA、αB和αC）构成[1]，可以特异性地识别ε-N-乙酰化赖氨酸残基，在招募基因转录因子等到乙酰化的染色质过程中发挥重要作用[2-3]。Brd功能紊乱与很多疾病的发生有关，特别是与肿瘤的发生关系尤为密切[4]。人体基因组编码超过50个溴结构域蛋白，从系统发生的角度可将这些蛋白分为8个亚家族。BET是其中的一个特殊群体，携带两个串联溴结构域（BDⅠ、BDⅡ）和一个ET结构域[5]，主要调节细胞增殖和细胞周期进程。黑腹果蝇的Fsh是已知的最古老的BET家族成员[6]。在酿酒酵母中，BET家族有Bdf1和Bdf2两个成员。两者结构相似，其中Bdf1是一种通用转录因子，介导酵母基因转录过程。基因分析表明，Bdf1还参与调控细胞生长和染色体重塑[7]。如果破坏Bdf1和Bdf2其中之一，并不会对酵母产生很大影响，但两者同时失去功能则会使酵母无法生存[8]。

在哺乳动物中，BET家族由Brd2、Brd3、Brd4和Brdt四个成员组成，它们具有相似的结构域。Brd2以前也称Ring3/frgs1，是一种有激酶活性的转录调节因子[9-10]。Brd3（也称为ORFX/fshrg2）和Brdt的报道较少。有研究表明，在小鼠中，Brdt通过乙酰化途径来影响染色质的构型[11]。Brd4，起初被称为MCAP（mitotic chromosome-associated protein），又被称为Fshrg4和Hunk1，它是一种特殊的染色体结合因子，不同于一般的核转录调节因子，可以在整个有丝分裂过程中始终结合到染色体上[12]。正常情况下，Brd4基因有两种不同的剪切形式，编码形成不同的亚型——短亚型和长亚型。长亚型Brd4具有2个BD结构域（BDⅠ、BDⅡ）、1个ET结构域、1个富含丝氨酸的SEED结构域和富含脯氨酸的C-末端区；较短的亚型保留具有结合染色质作用的BD结构域，但是缺乏结合P-TEFb的区域及富含脯氨酸的结构域[13]。

2 Brd4的生理功能

Brd4可以结合乙酰化组蛋白H3 Lys-14、H4 Lys-5/8/12，并招募其他的染色质修饰蛋白，从而诱导细胞的靶基因活化或抑制[14]；还可以结合乙酰化的非组蛋白，如γ疱疹病毒f73蛋白、NF-κB亚基Rel A等，来调控DNA复制、细胞周期、基因转录等其他细胞活动[15]。

2.1 Brd4在细胞周期中的作用

Brd4可以在细胞周期的不同时期发挥作用，具有复杂的生长调节活性。其表达水平可以被生长刺激信号上调或被生长抑制信号下调。在Brd4+/-杂合子细胞中，组蛋白H3的Lys-14和H4的Lys-12乙酰化水平降低，这表明Brd4可能在保持细胞染色质的普遍乙酰化状态方面发挥作用[16]。

在哺乳动物细胞的有丝分裂期，一些转录因子和调节蛋白从染色体上分离，如Sp1、CBP和一些溴结构域蛋白等，这与该时期的转录抑制相吻合。而在分裂期，Brd4仍结合在染色体上，这是Brd4最显著的特征。Maruyama等[17]的研究表明，Brd4在整个细胞周期均表达，Brd4在G1期表达下调有利于细胞向S期转化。Brd4过表达可以使正常细胞和肿瘤细胞发生G1/S期阻滞。Brd4的BDⅡ结构域，至少有一部分是通过与复制因子C（replication factor C，RFC）的亚基RFC-140相互作用而抑制RFC的功能，进而使细胞发生G1/S期阻滞。其中任何一个的水平或活性异常便可破坏Brd4与RFC之间的平衡状态，从而影响细胞周期进程。通过微阵列分析发现，与对照细胞相比，用Brd4 shRNA敲除Brd4后，细胞G1期的基因表达未增加，并且细胞生长减慢，发生G1期阻滞。重新表达Brd4可以挽救这些G1期基因的表达，并使细胞发生G1/S期转化。染色质免疫共沉淀测序分析表明，Brd4在G0～G1期被招募到G1期基因的启动子上，调节这些基因的转录，从而促使细胞向G1/S期转化。Brd4主要结合到含有常染色质和较少异染色质的区域，向增生细胞注射微量的Brd4抗体，会使细胞发生G2/M期阻滞。cyclinB-cdc2复合物结合到染色体上，是决定细胞是否进入到M期的关键，Brd4可能通过调节cyclinB-cdc2的活性以发挥其阻滞G2/M期转化的作用[18]。因此，Brd4在调节细胞周期进程中扮演重要的角色。

2.2 Brd4介导基因转录调控

近年的研究发现，在很多转录复合物中存在Brd4，包括通用辅助因子Mediator和P-TEFb，并且它能够以不依赖Tat的方式激活HIV的转录。另外，不同类型的HPV以Brd4作为适配器把病毒基因组锚定在宿主有丝分裂染色体上。Brd4与病毒编码的E2蛋白相互作用，有利于病毒基因组在有丝分裂过程中的分离。在HPV E2沉默复合物中也存在Brd4，E2沉默复合物可以抑制具有拮抗抑癌基因p53和pRB功能的E6、E7的表达。Brd4基因的活化或抑制转录的双重作用表明，Brd4可以招募不同的转录调节因子来调节启动子的活性。

利用人类细胞蛋白质与小鼠来源的Brd4进行免疫共沉淀时，Brd4可以与cyclin T1、CDK9、Mediator相互作用[19]。值得注意的是，Brd4仅存在于含有cyclin T1和CDK9的有活性的P-TEFb复合物中，而不出现于含有HEXIM1和7SK小核RNA的无活性的P-TEFb复合物内。在正常细胞中，两种活性的P-TEFb复合物等量存在[20]。Brd4与P-TEFb的相互作用提示Brd4可能参与了RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）介导的基因转录。Brd4确实可以刺激一些基因的表达，如C-Myc和C-Jun，还可以增强CDK9介导的PolⅡ的C-末端结构域（CTD）的磷酸化；去乙酰化酶抑制剂可以使Brd4招募更多有活性的P-TEFb复合物到启动子附近的乙酰化染色质，来促使PolⅡ介导的转录[19]。这些研究表明，Brd4在PolⅡ介导的转录过程中发挥了多重作用。此外，在有丝分裂过程中，核心组蛋白乙酰化程度降低，除Brd4、Brd2外，大量的转录调节因子被释放到胞质中导致转录抑制。然而，在此过程中，有些H4、H3仍保持乙酰化的状态，这可能与Brd4、Brd2的作用有关，该现象表明溴结构域蛋白可能在向子细胞传递转录记忆方面发挥重要作用[12]。

3 Brd4在肿瘤发生、发展中的作用

Brd4在不同组织中调控细胞周期进展和细胞分化。近年的研究发现，其在细胞恶性转化和肿瘤的进展中也具有重要作用，可能还参与肿瘤细胞的浸润和转移等过程。许多血液系统恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤、急性髓系白血病，以及乳腺癌、结肠癌和肺癌等均与Brd4功能紊乱有关。

3.1 Brd4与NMC

NMC是一种高度侵袭性的鳞状细胞癌，以获得性染色体重排为特点，常涉及NUT基因，形成Brd4¯NUT融合基因，也可以与未知的基因或Brd3形成 NUT¯variant融合基因[21-22]。大约有 2/3 的NMC患者具有互惠的染色体易位t（15q14，19p13.1），形成 Brd4¯NUT融合癌基因，其表达受Brd4的启动子控制。在正常情况下，NUT仅表达于减数分裂后的精子细胞中，是一种无结构的多肽，但是含有两个酸性的、潜在的蛋白结合结构域（AD1、AD2）。AD1可以结合并活化组蛋白乙酰转移酶P300（HAT），这导致精子细胞发生全局性的组蛋白乙酰化，随后染色质浓缩[23]。在正常细胞中，NUT蛋白以出核因子CRM1依赖的方式在细胞质与细胞核间穿梭，然而，Brd-NUT融合蛋白在整个细胞周期中一直结合在染色质上。由此可见，在NMC中，Brd4、Brd3可能在栓系NUT到染色体方面发挥作用[24]。

敲除 Brd4¯NUT 或 Brd3¯NUT，NMC 细胞中与鳞状分化相关的蛋白增加，如胞质角蛋白和外皮蛋白，并且核体积增大、核常染色质增多。随着时间的延长，这些细胞停止生长并且分化为圆形的、静止的鳞状细胞[24-25]。敲除Brd¯NUT融合蛋白基因的反应表明，Brd-NUT融合蛋白是一种重要的致病因素，它是阻滞肿瘤细胞分化的作用因子，应该突出针对这些蛋白为治疗靶点的重要性。

Brd4-NUT与乙酰化的染色质和P300的关系表明，Brd4-NUT可以改变细胞全局组蛋白的乙酰化状态，但是，它不是增加而是降低组蛋白的乙酰化状态，这种改变与很多基因表达水平降低相关。因此，提出一个假设：Brd-NUT隔绝了HAT或者表达终末鳞状分化相关基因所需的其他因子的活性[25]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂或者BET抑制剂，后者可抑制Brd-NUT融合蛋白结合到染色体，诱导NMC细胞终末分化。这为对常规化疗和放疗耐药的NMC靶向治疗提供了理论依据。

3.2 Brd4与血液系统肿瘤

急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是一种干细胞衍生的造血系统恶性肿瘤，以在骨髓、血液和其他器官中恶性增殖和原始粒细胞增多为特征。AML在遗传学和生物学水平具有高度异质性，是基因和表观遗传改变导致肿瘤发生的最好例证。2011年，Zuber等[26]通过筛选自定义文库中243种已知的针对染色质调节因子的shRNA，包括大多数表观遗传标记的“writers”、“readers”和“erasers”，发现 Brd4是维持由MLL-AF9和NrasG12D驱动的AML的重要因子。在体内外，用shRNA或者小分子BET抑制剂JQ1抑制Brd4具有稳定的抗白血病作用，包括终末骨髓分化和白血病干细胞的消除。最近的研究表明，Myc转录参与白血病干细胞的自我更新[27]。shRNA或者JQ1抑制Brd4可导致MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞的Myc mRNA和蛋白水平明显下降，并且这发生在巨噬细胞分化基因（如Cd74）的表达增加之前。染色质免疫共沉淀实验显示，Brd4结合到Myc启动子上游2 kb的位置，JQ1使两者的结合消失，这为Brd4调控Myc的转录提供了直接证据。异位表达Myc cDNA几乎完全阻止JQ1、Brd4 shRNA诱导的细胞形态变化及细胞周期阻滞。这说明抑制Brd4至少是通过下调具有促进异常自我更新作用的Myc的表达而发挥部分作用；然而，异位表达Myc不能阻止JQ1诱导的细胞死亡，说明Brd4还可以通过不依赖Myc的途径调节AML细胞的生存。

与对MLL融合的AML细胞系的作用相似，BET抑制剂也可以诱导不同的非MLL融合的AML细胞系发生凋亡及G0/G1期阻滞[28]。Dawson等[29]用三个独立的蛋白质组学方法发现，HL60细胞中Brd4与一部分野生型NPM1相互作用，发现在AML患者的肿瘤样本中部分Brd4与野生型NPM1有共定位。先前已证明突变型NPM1（NPM1c）诱导过量的NPM1到细胞质[30]。但是在NPM1突变的OCI-AML3细胞中，大多数的Brd4仍位于细胞核。因此，Dawson等认为，NPM1-Brd4相互作用抑制两者形成的复合物中Brd4的转录活性，位于细胞质的NPM1无法发挥抑制Brd4的转录活性，从而导致基因异常表达。用CRM1抑制剂LMB恢复NPM1-Brd4的相互作用，可使依赖Brd4的基因表达下调，如Bcl2和CMyc，该结果支持上述推理。这些研究阐明了NPM1c AML的发病机制，并且为BET抑制剂治疗多种AML亚型提供了前期理论依据。

Brd4是治疗血液病的一个良好靶点。BET抑制剂对多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤同样具有高效的抗肿瘤活性[31-33]。BET抑制剂可下调一组基因的表达，这些对BET抑制剂敏感的基因多具有超级增强子。发生机制可能是BET抑制剂干扰了Brd4与肿瘤细胞中的超级增强子的结合，从而抑制了一组基因的转录，包括Bcl2、C-Myc等，进而发挥其抗肿瘤活性的作用。

3.3 Brd4与乳腺癌

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。Hunter等[34-35]利用遗传学、功能基因组学和全基因组表达分析的综合方法，发现Brd4或Brd4相关通路可能在小鼠和人类的乳腺癌进展中发挥重要的作用。体外实验表明活化的Brd4可降低高侵袭小鼠乳腺肿瘤细胞的转移和运动能力，但不影响其增殖能力。但是，将同样的肿瘤细胞种植到裸鼠，表达Brd4的小鼠则较少发生肿瘤转移。并且与细胞实验不同的是，小鼠肿瘤的体积也较小。研究人员推测，这种活体实验中肿瘤大小的差异可能反映了Brd4对肿瘤微环境的影响力。

为了阐释Brd4在乳腺癌侵袭易感性方面的作用机制，有研究[36]采用亚型和结构域分析的方法发现，删除Brd4的BD不会对Brd4促进乳腺癌转移的能力产生影响；表达自然截短的Brd4可恢复其促进肿瘤进展和转移的能力；删除长亚型Brd4富含脯氨酸的区域，可诱导细胞间充质样转化和获得癌干细胞样特性（该变化是由羧基末端的P-TEFb结合区域介导的），并且删除富含脯氨酸的结构域可诱导表达更差的预后基因标签，该表达标签与人类G3级乳腺癌组织的基因标签重合。同时，长亚型Brd4含有抑制（富含脯氨酸结构域）和促进（P-TEFb结合区域）乳腺癌侵袭转移的作用，短亚型Brd4无富含脯氨酸结构域，只具有促进侵袭转移的能力。但是，这些结构域发挥作用的具体机制仍需更深入的研究。因此，可以推测短亚型可能与长亚型竞争结合乙酰化的组蛋白，从而干扰长亚型的功能，乳腺癌的转移易感性取决于两种亚型的比例。这些结果表明，Brd4介导的肿瘤转移易感性是促进与抑制双重作用的综合结果，进一步研究Brd4调控的靶点有可能揭示乳腺癌上皮发展及恶性进展相关的重要过程。

3.4 Brd4与其他肿瘤

Brd4识别乙酰化的染色质并招募不同的因子，作为染色质的“适配器”调控很多基因的表达。由于其广泛的生物学功能，Brd4不仅与上述肿瘤有关，还与很多其他肿瘤密切相关。在肺癌中，Brd4结合FOSL1的增强子调节FOSL1的表达，FOSL1与JUN家族形成二聚体来调节AP-1靶基因的表达。BET抑制剂可以通过影响Myc转录过程来抑制恶性血液病细胞系的周期进程。但是，在肺腺癌中，BET通过与FOSL1而非Myc的相互作用来诱导细胞周期阻滞[37]。在人类结肠癌细胞系和原发性肿瘤中，启动子异常的高甲基化导致Brd4表达下调，重新异位表达Brd4可以明显抑制肿瘤生长，这表明Brd4在人类结肠癌中扮演重要角色。另外，在甲基化状态正常的结肠癌细胞系中，Brd4水平仍然比正常细胞低，这说明还有其他机制调节Brd4的表达，如组蛋白乙酰化状态、组蛋白甲基化状态[38]。但是，黑色素瘤细胞系中Brd4扩增及表达水平却增高，敲除Brd4或BET的小分子抑制剂导致大多数的黑色素瘤细胞系发生G1期阻滞及分化更好的形态学改变[39]。总之，在不同细胞中，Brd4调控的靶基因可能不同，使得其抑制剂在不同肿瘤中发挥的作用也不同。

4 B E T抑制剂

近年来，越来越多的学者开始采用以调控表观遗传和维持肿瘤细胞特性的转录过程为靶点的治疗策略。BET蛋白是在染色质重塑和转录调节过程中发挥重要作用的表观遗传“readers”，随着对BET蛋白功能认识的不断深入，探索靶向抑制Brd展示的抗肿瘤活性正成为研发抗肿瘤药物的新途径。根据化学结构，将强效BET抑制剂分为3 类：异恶唑类、酰胺/脲类和 1’2’4-三唑类[40]。IBET-762、JQ1是常见的BET抑制剂，它们抑制BET蛋白与乙酰化组蛋白的结合[41-42]。BET抑制剂已经显示出强大的抗肿瘤活性，I-BET-762治疗NMC的Ⅰ期临床试验正在进行（NCT01587703）。研究BET抑制剂，为肿瘤的治疗提供了新途径。以表观遗传为基础来治疗肿瘤需解决的一个重要问题便是药物的非特异性，尽管BET抑制剂可能具有较高的特异性，但BET蛋白与很多基因调控过程有关，且具有组织特异性。学者们可以预测这些化合物的毒性，但脱靶效应的机制尚未阐明。目前只是初步了解BET靶点的潜在治疗价值。

5 小结与展望

综上所述，Brd4异常会导致很多基因表达失调，与肿瘤细胞的分化、增殖、凋亡、侵袭转移等过程有关，其在肿瘤的发生、发展过程中具有至关重要的作用。此外，以Brd4为靶点的治疗显示出强大的抗肿瘤活性。然而，关于Brd4的研究仍然有许多问题亟待解决。虽然研究已经证实，许多基因（如C¯Myc、FOSL1等）为Brd4的靶基因，但Brd4有更多的靶基因尚未被发现。因此，现有的研究结果还不能完全阐明Brd4在肿瘤进展中的全部作用，Brd4的确切作用机制有待进一步研究。但是，相信随着研究的不断深入，这些问题终将被解决，Brd4必将成为治疗肿瘤的新靶点。

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