不同氯吡格雷疗效检测指标的相关性及与心血管事件的关系

唐宁，徐向东，朱耀武，孙自镛， 潘莹莹，郭小梅，秦瑾，尹世玉

不同氯吡格雷疗效检测指标的相关性及与心血管事件的关系

唐宁，徐向东，朱耀武，孙自镛， 潘莹莹，郭小梅，秦瑾，尹世玉

目的：了解常用氯吡格雷疗效检测指标间的相关性和对心血管事件的预测能力，为选择合适的检测方法提供初步依据。

方法：同时使用二磷酸腺苷（ADP）诱导光学浊度法（LTA）血小板聚集试验、血栓弹力图（血小板图）试验、血管扩张刺激磷蛋白磷酸化试验（VASP）和CYP2C19基因型分析，检测接受氯吡格雷治疗的178例急性冠状动脉综合征患者的血小板功能，根据回访178例患者6个月发生主要不良心血管事件（MACE）情况，分为MACE组（n=21）和非MACE组（n=157），分析各检测结果相关性和对不良心血管事件的预测能力。

结果： 以LTA血小板最大聚集率（LTA-PAmax）＞46%、血小板图ADP诱导的血小板最大振幅（MAADP）＞47 mm和VASP血小板反应指数（VASP-PRI） ＞50%提示氯吡格雷抵抗的发生率分别为27.0%、24.2%和61.2%。178例患者中，CYP2C19快代谢型、中间代谢型、慢代谢型分别为81例（45.5%），72例（40.5%）和25例（14.0%），三型间VASP-PRI均有显著差异（P＜0.001）并呈基因剂量效应（慢代谢型＞中间代谢型＞快代谢型）；多变量Logistic回归分析中，LTAPAmax＞46%和MAADP＞47 mm为6个月MACE发生的独立危险因素[比值比（OR） = 5.99， 95% 可信区间（CI）: 2.00～17.96，P=0.001 及OR=4.72， 95% CI: 1.27～19.67， P=0.013]。

结论： 中国人群中存在较高比例的CYP2C19功能丢失基因型，且与治疗后血小板高反应性相关；LTA-PAmax与MAADP是接受氯吡格雷治疗的急性冠状动脉综合征患者发生不良心血管事件更有效的预测指标。

氯吡格雷；血小板功能检测；CYP2C19基因型

Methods: There were 4 tests conducted at the same period of time, ①ADP induced light transmission aggregometry (LTA), ②thrombelastography (TEG), ③vasodilator-stimulated phosphor protein phosphorylation (VASP) and ④CYP2C19 loss of function genotype analysis. A total of 178 ACS patients with clopidogrel treatment were retrospectively studied, the patients were divided into MACE group, n=21 and Non-MACE group, n=157 to compare the effect of different test with the predictive value for MACE occurrence at 6 months after medication.

Results: The ADP-induced maximum platelet aggregation rate (LTA-PAmax) ＞ 46%, ADP-induced plateletfibrin clot strength (MAADP) ＞ 47mm and VASP platelet reactivity index (VASP-PRI) ＞ 50% indicating the occurrence rate for clopidogrel resistance were at 27.0%, 24.2% and 61.2% respectively. The CYP2C19 genotype

analysis presenting the patients with extensive metabolizers (EMs), intermediate metabolizers (IMs) and poor metabolizers (PMs) were at 81 (45.5%), 72 (40.5%) and 25 (14.0%) respectively. The VASP-PRI values were different among the patients with EMs, IMs and PMs as PMs ＞ IMs ＞ Ems, P＜0.001. Multivariate analysis demonstrated that LTA-PAmax ＞ 46% and MAADP＞ 47mm were the independent risk factors for MACE occurrence in ACS patients at 6 months after medication (OR: 5.99, 95% CI: 2.00- 17.96, P=0.001) and (OR: 4.72, 95% CI: 1.27-19.67, P=0.013).

Conclusion: There was higher ratio of CYP2C19 loss of function genotypes, which might be related to higher platelet reactivity after medication. LTA-PAmax and MAADPwere the better predictors for MACE occurrence in ACS patients after clopidogrel treatment.

(Chinese Circulation Journal, 2015, 30:144.)

氯吡格雷作为急性冠状动脉（冠脉）综合征及经皮冠脉介入治疗手术患者的主要治疗药物，已是使用最为广泛的抗血小板药物之一，但其抗血小板效果存在个体差异，即氯吡格雷抵抗现象。为了评估氯吡格雷疗效继而为患者制定个性化的治疗方案，减少血栓及出血事件的发生，目前有越来越多的血小板功能检测方法问世，用以了解氯吡格雷治疗后血小板的残余反应性。本研究同时使用目前常用的几种血小板功能检测方法，对应用氯吡格雷抗血小板治疗的急性冠脉综合征患者的血小板功能进行检测，并评估检测结果与预后的相关性，试图对各项检测方法的指标进行初步比较，筛选出指导抗血小板治疗更有价值的方法。

1 资料和方法

研究对象：2012-12-10至2014-01-31入我院心血管科治疗患者。纳入标准：诊断为急性冠脉综合征并常规使用氯吡格雷治疗的患者，排除标准：患血小板功能缺陷疾病，血小板计数＜100×109/L，常规服用口服抗凝药期间，一个月内接受过大型手术。对所有纳入对象回访6个月内主要不良心血管事件[MACE，包括心原性死亡、非致死性心肌梗死、（再次）接受血运重建术]发生情况，根据6个月内是否发生MACE分为MACE组（n=21）和非MACE组（n=157）。

标本采集和处理：采集标本时间为距服用氯吡格雷负荷剂量至少12 h，或服用氯吡格雷维持剂量期间，距终止使用血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂替罗非班至少48 h。每位患者分别使用含3.2%枸橼酸钠抗凝剂及肝素锂抗凝剂真空管采集空腹全血。枸橼酸钠抗凝血1 000 r/min离心10 min制备富血小板血浆，3 000 r/min离心10 min制备贫血小板血浆，用于血小板聚集试验。

检测方法：①血小板聚集试验：采用光学浊度法（LTA），以终浓度5 μmol/L的二磷酸腺苷（ADP）为诱导剂，在AggRAM血小板聚集仪（美国HELENA公司）上检测5 min内LTA血小板最大聚集率（LTA-PAmax），使用枸橼酸钠抗凝标本2 h内完成检测。②血栓弹力图（血小板图）试验：使用5000型血栓弹力图仪（美国血液技术公司）及其ADP检测试剂盒，按照试剂说明书的方法，检测ADP诱导的血小板最大振幅（MAADP），使用枸橼酸钠抗凝标本及肝素锂抗凝标本2 h内完成检测。③血管扩张刺激磷蛋白磷酸化试验（VASP）：采用流式细胞术，使用BD FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）及VASP检测试剂盒（法国STAGO公司），按照试剂说明书的方法，检测血小板反应指数（PRI），使用枸橼酸钠抗凝标本24 h内完成检测。④CYP2C19基因型分析：采用基因芯片技术，使用CYP2C19基因检测试剂盒（上海百傲公司），检测CYP2C19*1、*2、*3等位基因， *1/*1基因型为快代谢型，*1/*2或*1/*3基因型为中间代谢型，*2/*2、 *3/*3或*2/*3基因型为慢代谢型，枸橼酸钠抗凝标本采集后-70℃冷冻保存，6个月内完成检测。

统计学分析：使用SPSS 13.0统计软件，对不同预后及不同CYP2C19代谢型间血小板反应性比较采用Man-Whitney U检验，率的比较采用卡方检验。评估6个月发生MACE的独立危险因素采用多因素Logistic回归分析，并了解各实验室指标对MACE发生的阳性及阴性预测值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

整个观察期间15例患者失访或未坚持用药，最终纳入178例急性冠脉综合征患者并进行血小板功能检测。其中101例为不稳定型心绞痛，77例为急性心肌梗死，这些患者中147例接受了经皮冠脉介入治疗手术。175例同时服用氯吡格雷和阿司匹林，使用常规剂量氯吡格雷（300 mg负荷剂量，75 mg维持剂量）的有168例，使用加强剂量氯吡格雷（600 mg负荷剂量，150 mg维持剂量）的有10例。

各项血小板功能试验检测治疗后血小板反应性：根据以往研究建议[1，2]，分别以5 μmol/L ADP诱导LTA-PAmax ＞46%、血小板图MAADP＞47 mm及VASP-PRI＞50%作为氯吡格雷抵抗的判断阈值。178例患者中，血小板聚集试验提示氯吡格雷抵抗发生率为27.0%（48例），血小板图试验提示氯吡格雷抵抗发生率为24.2%（43例），两种方法间氯吡格雷抵抗发生率差异无统计学意义（P＞0.05）；而VASP试验提示氯吡格雷抵抗发生率为61.2%（109例），显著高于前两种方法的指标（P＜0.05）。

CYP2C19各基因型及治疗后血小板反应性间的比较：纳入的178例患者中CYP2C19快代谢型、中间代谢型、慢代谢型分别为81例（45.5%）、72例（40.5%）和25例（14.0%），三者的VASP-PRI分别为（49.0±17.5）%、（60.4±13.7）%和（73.2±8.9）%，两两比较差异均有统计学意义（P＜0.001），慢代谢型最高，快代谢型最低；而三者的LTA-PAmax分别为（32.1±19.3）%、（30.6±17.2）%和（46.0±23.0）%；MAADP分别为（37.7±13.7）mm、（44.5±12.1）mm和（51.9±13.0）mm，慢代谢型LTA-PAmax与MAADP均较快代谢型、中间代谢型更高（P＜0.001），快代谢型、中间代谢型间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。图1

各项检测指标与预后的相关性：对178例患者进行6个月回访，其中非MACE组157例，MACE组21例，包括5例心原性死亡，13例发生非致死性心肌梗死，3例再次接受经皮冠脉介入治疗手术。MACE组与非MACE组间临床资料、治疗后血小板反应性和基因型的比较见表1。血管紧张素转换酶抑制剂使用率、LTA-PAmax和MAADP差异均有统计学意义 （P＜0.05）。利用多因素Logistic回归分析，将上述检测变量及表1中P＜0.1的临床变量（糖尿病病史、使用血管紧张素转换酶抑制剂、使用他汀类药、CYP2C19慢代谢型）作为自变量，评估其与6个月MACE相关性，LTA-Pamax及MAADP均与MACE发生独立相关[比值比（OR）= 5.99， 95%可信区间（CI）: 2.00～17.96， P=0.001 及OR = 4.72，95% CI: 1.27～19.67， P=0.013]，除血管紧张素转换酶抑制剂使用率外，其他临床变量均被排除出模型（表2）。LTA-PAmax＞46%对6个月MACE的阳性预测值（33.3%）及阴性预测值（97.6%）均为最高，而VASPPRI＞50%的阳性预测值（11.6%）最低，CYP2C19慢代谢型的阴性预测值（90.1%）最低。表3

图1 不同CYP2C19基因型的治疗后血小板反应性

表1 两组患者间临床资料、治疗后血小板反应性和基因型的比较

表2 以6个月主要不良心血管事件发生为因变量的多因素Logistic回归分析

表3 各项检测变量对主要不良心血管事件的预测能力（%）

3 讨论

目前用于氯吡格雷疗效监测的方法越来越多，方法间检测原理、诊断效率各异，为了选择合适的临床实验室检测方法，有必要了解这些方法指标间的相关性及其与预后的关系。本研究使用的方法中，血小板聚集试验使用最为广泛，设备要求较低，为血小板功能试验的“金标准”，局限包括需进行样本前处理、对操作人员熟练程度有较高要求；血小板图试验利用血栓弹力描记术检测全血标本，操作简便，可床旁检测，局限包括成本较高、临床研究数据较少[3]；另外血小板聚集试验与血小板图试验检测均基于血小板聚集的发生，在评估氯吡格雷疗效时，还可能受其他抗血小板药物影响，如环氧化酶抑制剂（阿司匹林）的协同效应，及血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂对血小板聚集最终途径的阻断效应；而VASP检测基于P2Y12受体途径的活化，是特异性最高的P2Y12受体抑制剂检测方法，不受其他抗血小板药物的影响，其局限包括步骤较繁琐、设备要求较高[1]。

细胞色素P450（CYP）在氯吡格雷的代谢中起重要作用，既往研究显示，非功能性等位基因如CYP2C19 *2、*3携带者的氯吡格雷血浆活性代谢物水平较低，导致体内残留血小板活性增高，因此CYP2C19基因型检测被认为可预测患者对氯吡格雷的敏感性继而指导治疗[4]。目前常用的基因芯片法操作简便、结果可靠。本研究中CYP2C19快代射型、中间代射型、慢代射型间VASP-PRI水平均差异显著，证实了中国人群中CYP2C19非功能性等位基因与氯吡格雷治疗后血小板残余反应性密切相关。但亚洲人群较高的CYP2C19功能丢失基因多态性发生率（本研究为54.5%，日本一项研究达60.0%[5]，与以往对亚洲人群的研究[6-9]一致），及VASP-PRI提示氯吡格雷抵抗发生率过高（本研究为61.2%），可能导致CYP2C19基因型分析与VASP-PRI反映中国人群氯吡格雷抵抗的特异度降低。事实上，一项关于CYP2C19基因型、氯吡格雷代谢、心血管事件的Meta分析表明，即使在CYP2C19非功能性等位基因携带率较低的西方人群中，基因型与心血管事件间也没有发现显著相关性[10]。Judge等[11]的研究表明，当VASP检测PRI在60%～100%之间时，P2Y12受体的实际阻断数量差异很大。Bonello等[12]观察到接受普拉格雷治疗患者VASP检测结果可预测随访1年内发生缺血及出血事件，他的研究中使用PRI＞53.5%定义治疗后血小板高反应性，仅22.3%的患者被认为使用普拉格雷后血小板活性抑制不足，这也提示治疗后血小板高反应性的发生比例对VASP-PRI的预测能力有重要影响。

由于多数服用氯吡格雷的患者同时服用阿司匹林等抗血小板药，相对于VASP与CYP2C19基因检测，基于血小板聚集终点的LTA血小板聚集试验和血小板图试验可能更能反映多种药物的协同作用，本研究多因素分析中仅LTA-PAmax和MAADP与急性冠脉综合征患者6个月内发生MACE独立相关，这与以往对LTA-PAmax和MAADP与缺血事件相关性的研究结果一致[2]。质子泵抑制剂的使用在不同预后人群间没有显著差异，因此其与氯吡格雷联用可能增加的缺血事件风险[13]不会影响我们的研究结论。有趣的是，我们的结果提示血管紧张素转换酶抑制剂的使用也与预后独立相关，表明心力衰竭相关治疗不足也可能是缺血事件的危险因素。

虽然血小板功能试验所检测到的血小板残余反应性已被大量研究证实与急性冠脉综合征及经皮冠脉介入治疗手术后患者缺血事件的发生相关[12,14,15]，但最近的一个大规模临床研究结果表明，依据一个血小板功能试验（如Verifynow）结果进行抗血小板治疗方案调整，并未显著减少缺血事件的发生[16]。有人认为由于血小板活化途径多样，依靠单个功能试验未必能够反映其整体活化状态，因此依据基于不同方法学的多个功能试验结果来调整抗血小板治疗方案，可能是抗血小板个性化

治疗的出路[17]。

本研究表明中国人群中存在较高比例的CYP2C19功能丢失基因型，并与治疗后血小板高反应性相关；LTA-PAmax与MAADP可能是预测接受氯吡格雷治疗急性冠脉综合征患者发生MACE更有价值的指标。本研究样本量有限，要明确各类实验室方法的指标及其联合应用的临床指导意义，有赖于更大样本量、干预性的临床研究。

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Comparison of Different Testing Method on Clopidogrel Effect With the Predictive Value of Major Adverse Cardiovascular Event Occurrence in ACS Patients

TANG Ning, XU Xiang-dong, ZHU Yao-wu, SUN Zi-yong, PAN Ying-ying, GUO Xiao-mei, QIN Jin, YIN Shi-yu.
Department of Laboratory Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan (430030), Hubei, China

Objective: To compare different testing method on clopidogrel effect with the predictive value of major adverse cardiovascular event (MACE) occurrence in ACS patients in order to provide the proper examination in clinical practice.

Clopidogrel, Platelet function test, CYP2C19 genotype

2014-07-25）

（编辑：漆利萍）

430030 湖北省武汉市, 华中科技大学同济医学院附属同济医院 检验科（唐宁、徐向东、朱耀武、孙自镛、潘莹莹），心血管科（郭小梅、秦瑾），综合医疗科（尹世玉）

唐宁 主管技师 硕士 研究方向：血栓与止血实验室诊断 Email：tonyjesus@126.com 通讯作者： 孙自镛 Email：ziyongsun@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2015）02-0144-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.02.013