藏药二十五味珊瑚丸中马兜铃酸A及汞盐等重金属含量测定

刘凤玲李子璇聂丽娟阿呷尔布袁瑞英王聚乐

（①菏泽家政职业学院 山东菏泽274300②③④⑤⑥西藏大学医学院 西藏拉萨850000）

藏药二十五味珊瑚丸中马兜铃酸A及汞盐等重金属含量测定

刘凤玲①李子璇②聂丽娟③阿呷尔布④袁瑞英⑤王聚乐⑥

（①菏泽家政职业学院 山东菏泽274300②③④⑤⑥西藏大学医学院 西藏拉萨850000）

藏药二十五味珊瑚丸处方中的木香在流通和使用过程中存在与含马兜铃酸的青木香混用现象。文章建立RP-HPLC法（流动相：甲醇-0.05%冰醋酸（62：38）；检测波长：250nm；柱温：30℃；流速：1mL/min）测定处方中马兜铃酸A的含量，并采用2010年版《中国药典》重金属检查法第二法、硫氰酸铵滴定法，分别测定了二十五味珊瑚丸处方样品中的重金属总量和硫化汞的含量，采用一般鉴别试验对可溶性汞盐进行检查，控制其质量，保证临床使用安全性。马兜铃酸A和可溶性汞盐在样品中均未检出；所检测样品中重金属总含量在200～225ppm之间；硫化汞平均含量为29.75mg·g-1，RSD为0.56%。结果表明，藏药二十五味珊瑚丸中木香的来源控制较好；重金属总含量较高，有必要进一步分析重金属成分是否为本品的活性必需成分以及是否具有毒性。本研究中硫氰酸铵滴定法测定硫化汞的含量方法简便、结果准确、重复性好，可用于藏药二十五味珊瑚丸的质量控制。

藏药二十五味珊瑚丸；马兜铃酸；重金属；汞盐

二十五味珊瑚丸藏药保护品种，由珊瑚、珍珠母、诃子、木香、沉香、朱砂、龙骨、炉甘石等25味药材组成，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药》第一册及《中国药典》(2010版)中，具有开窍、通络、止痛、调和血压之功效，临床上用于顽固性头痛、白脉病、脑炎、头晕目眩、肢体麻木僵硬、神志不清、血压不调、抽风痉挛等病症的治疗[1]。

二十五味珊瑚丸处方中的木香（Aucklandia lappa Decne的干燥根）由于中药常见的同名异物、名字相似等原因，在流通和使用过程中可能与含马兜铃酸的青木香（马兜铃科植物马兜铃Aristolochia debilisSieb. Et Zucc.的干燥根）混淆。近年来，大量国内外研究证明该成分表现了强烈的致癌作用[2]和肾毒性[3-4]，因此有必要对二十五味珊瑚丸中马兜铃酸进行监控，保证其临床使用的安全性。

二十五味珊瑚丸所含朱砂（主要含HgS）、青金石（硫和氯的钠钙铝硅酸盐）、炉甘石（主要含ZnCO3）、磁

石（主要含Fe3O）、禹余粮（主要含FeO(OH)）等多种矿物药是其发挥疗效的部分物质基础，然而其富含的各种重金属元素对人体潜在的毒性也值得关注。但是其质量标准中却没有重金属相关的检测。为了保证其临床用药的安全有效，本研究采用《中国药典》重金属检查法第二法检测重金属总量，用硫氰酸铵滴定法测定硫化汞的含量，同时采用一般鉴别试验对可溶性汞盐进行了检查，期望为二十五味珊瑚丸的质量控制提供科学的依据。

1 实验仪器和试药

岛津LC-10A高效液相色谱仪，配CLASS-VP5.03色谱工作站；色谱柱：KromasilC18（4.6mm×200mm，5μm）；北京赛多利斯BT25G电子天平（万分之一）。

二十五味珊瑚丸（09158A）由西藏自治区藏药厂提供；马兜铃酸A标准品（中国药品生物制品检定所，110746-200507）；朱砂，购于四川省华安堂药业连锁有限公司；甲醇色谱纯，水为超纯水（自制）；甲醇、冰醋酸均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司出品；硫氰酸铵、硝酸钾、高锰酸钾、硫酸亚铁、硫酸等试药，天津市光复精细化工研究所出品。

2 方法和结果

2.1 马兜铃酸A含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（4.6×200mm）；流动相：甲醇-0.05%冰醋酸（62：38）；检测波长：250nm；柱温：30℃；流速：1ml/min。

2.1.2 对照品及供试品溶液制备

精密称取5mg马兜铃酸A对照品，用甲醇定容至25m l容量瓶中，贮存于4℃冰箱中备用。

精密称取二十五味珊瑚丸5g，粉碎，加入甲醇-甲酸（98：2）溶液250ml，称定重量，水浴加热回流1h。冷却后，称定重量，补足失重。过滤，水浴挥干后用甲醇-甲酸（98：2）溶解并定容至5ml容量瓶中。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取2.1.2项中所列对照品溶液各10μl，照2.1.1色谱条件进样，记录色谱图。以峰面积为纵坐标、对照品溶液浓度（mg/ml)为横坐标进行线性回归，回归方程为：y=2E+08x+729618，r= 0.9999，说明对照品进样量在0.5305～0.9549μg间，线性关系良好。

检测限与定量限：精密吸取标准储备液1ml，至50ml容量瓶，定容，得浓度为0.01061mg/m l的标准对照溶液。分别精密吸取该对照溶液10、8、6、4、2、1μl进样，记录色谱图。以信噪比2：1作为检测限，信噪比10：1为定量限，计算马兜铃酸A的最低检测限为10.4ng，最低定量限为68.6ng。

精密度试验：取同一对照品溶液，按2.1.1色谱条件，连续进样6次，所得马兜铃酸A峰面积RSD为1.15%，表明检测方法精密度良好。

重复性试验：精密称取二十五珊瑚丸粉末6份，每份5g，精密称定，分别加入马兜铃酸A标准品0.2704mg，按2.1.2项制备6份供试品溶液，并按2.1.1色谱条件检测、计算马兜铃酸A含量RSD，结果为2.49%，表明检测方法重复性较好。

稳定性试验：取重复性试验供试品溶液，按2.1.1色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24h进样，计算马兜铃酸A峰面积RSD，结果为1.79%，表明样品溶液在24h内稳定。

加样回收试验：精密称取5g样品粉末各3份，分别加入马兜铃酸对照品0.2080、0.2704、0.3120mg，照2.1.2制备供试品溶液，按2.1.1色谱条件连续检测3次，计算回收率（见表1）。

2.1.4 样品测定

取二十五珊瑚丸粉末5g，按2.1.2项制成供试品溶液。另取样品2.5g，加入马兜铃酸A标准品适量，按2.1.2制成供试品溶液，以2.1.1项下色谱条件测定。结果显示，样品中未测出马兜铃酸A，而加入马兜铃酸A标准品的药品中马兜铃酸A的含量为131.25μg，与对照品加入量相当，色谱图见图1。

2.2 重金属含量检测

2.2.1 标准铅溶液的制备

依药典配制标准铅溶液(10μg·m l-1)

2.2.2 样品测定

表1 马兜铃酸A含量测定加样回收试验结果

图1 马兜铃酸A及二十五味珊瑚丸样品HPLC图对比

取本品适量，研细，过20目筛，混匀，分取0.2g，平行操作6份，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，自然冷却，加硫酸0.5m l，使湿润，低温加热至硫酸除尽后，加硝酸0.5m l，蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，自然冷却，在500～600℃炽灼5h，使完全灰化，自然冷却，加盐酸2m l，置水浴上蒸干后加水15m l，滴加氨试液至对酚酞指示液显微粉红色，再加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2m l，微热溶解后，用G4玻砂漏斗抽滤，残渣用少量蒸馏水洗涤，滤液及洗液合并，移置纳氏比色管中，加水稀释至25m l；另取配制供试品溶液的试剂各5份，

置瓷皿中蒸干，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2m l，微热溶解后，分别移置5支纳氏比色管中，依次加标准铅溶液3、3.5、4、4.5、5mL，再滴加少量稀焦糖溶液，并用水稀释至25ml使之与样品溶液一致；再在上述11支管中，分别加硫代乙酰胺试液各2m l，摇匀，放置2min，同置白纸上，自上向下透视，比较供试品管中与各标准铅管的颜色。计算，即得本品中重金属含量范围，结果见表2。

2.3 硫化汞含量测定

2.3.1 硫氰酸铵滴定法

取本品适量，研细，过20目筛，混匀，精密称定约5g，置250ml锥形瓶中，加硫酸30ml与硝酸钾5g，加热至溶液淡黄白色，冷却后加人50m l水稀释溶解。精密转移至100m l量瓶中，用少量去离子水分次洗涤锥形瓶，后将洗液并入溶液中定容后摇匀，滤过。精密量取续滤液80ml，置250ml锥形瓶，滴加1%高锰酸钾溶液至显粉红色，若2min内不消失，再滴加2%硫酸亚铁溶液，至粉红色消失后加硫酸铁铵指示液2m l，用硫氰酸铵滴定液（0.1mol·l-1）滴定。每1m l硫氰酸铵滴定液（0.1mol·l-1）相当于11.63mg的硫化汞（HgS）。

2.3.2 稳定性试验

取同一批号样品5份，每份5g，精密称定，按2.3测定法平行操作，平均含量为29.60mg·g-1，RSD为0.82%，表明重复性良好。

2.3.3 加样回收试验

朱砂中硫化汞含量测定：按照2010年版《中国药典》(一部)朱砂项下含量测定方法，测得朱砂粉末中HgS含量为98.72%，RSD=0.45%（n=6），以其作为HgS对照品进行回收率试验。

取同一批号样品6份，各约2.5g，精密称定，精密加入上述HgS对照品（含量98.72%),按2.3测定法平行操作，平均回收率为99.64%，RSD为1.64%，表明该方法可靠，准确度高，结果见表3。

2.3.4 样品含量测定

取本品3份，按2.3测定方法平行操作，测定结果见表4。

表2 二十五味珊瑚丸中重金属含量

表3 硫氰酸铵滴定法测定硫化汞的含量加样回收试验结果

表4 二十五味珊瑚丸中硫化汞含量

2.4 可溶性汞盐的阴阳性检验

取本品适量，研细，过20目筛，混匀，取5g，加水20ml，搅匀，滤过，静置，按《中国药典》中汞盐的鉴别反应进行检验，汞盐鉴别反应呈阴性。

3 讨论

参考高效液相色谱测定马兜铃酸A的相关方法对二十五味珊瑚丸中马兜铃酸A进行了测定，样品中未测出马兜铃酸A。考虑到中药成分复杂和含量微量等问题，为避免前处理过程中二十五味珊瑚丸中马兜铃酸A未被提取出损失、或测定过程中含量过低而未被检出的问题，本试验在对方法学考察的同时，假设二十五珊瑚丸中含有青木香，在制备供试品的同时，在二十五味珊瑚丸中加入一定量的马兜铃酸A对照品平行制备和测定样品。结果表明，与马兜铃酸A对照品图谱比较而言，未加入马兜铃酸A的样品中相应位置无马兜铃酸A色谱峰，而加入马兜铃酸A的样品中出现马兜铃酸A色谱峰，且含量经计算后与加入量基本一致。由此可推断，该批二十五珊瑚丸样品中不含马兜铃酸A。说明该样品中没有木香与青木香的混用。由于本试验使用二十五珊瑚丸样品数量极为有限，为了保证本品临床使用的安全性，在生产过程中对原料品种、品质严格控制的同时，仍然需要继续对二十五珊瑚丸中马兜铃酸A进行监控。

二十五味珊瑚丸中含有多种矿物药品，如珊瑚、朱砂、龙骨、炉甘石、脑石、磁石、禹粮土，富含汞、锌、铁等重金属元素。这些矿物类药物既是二十五味珊瑚丸的有效成分，又是毒性成分。例如朱砂具有清心镇惊，安神解毒，但现代研究发现长期大量使用朱砂，重金属在体内蓄积，造成严重的肝、肾功能损害，并可能损害人的血液系统和神经系统[5-7]。亦有研究发现，朱砂的毒性成分主要是容易被人体吸收的游离汞及可溶性汞盐，可造成多个器官的损害[8]。本试验用硫氰酸铵滴定法测定硫化汞的含量，方法简便、结果准确、重复性好；同时，结合一般鉴别试验对可溶性汞盐进行检查，可有效控制本品中的朱砂的用量和毒性反应。

重金属总量检测发现二十五味珊瑚丸样品中重金属总量达200～225ppm，远远超据国家商务部于2001年颁发的《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》[9]有关药材重金属元素限量标准（20ppm）所规定的限量要求，这些重金属主要来源于本品中的矿物类药。有文献[10]报道，二十五味珊瑚丸中矿物元素主要以不溶性固态存在，占70%以上，仅少部分以有机结合态和游离态形式存在。这些重金属是否为本品的活性必需成分以及是否对人体产生蓄积毒性还有待深入研究。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[S].北京:化学工业出版社,2005:292-293．

[2]De Smet PA G M.Adverse effectsofherbaldrugs[J].Springer-verlag Berlin Heidelberg,1992,(1):79-89．

[3]Vanherweghem JL,Depierreux M,TielemansC,et al.Rapidly progressive intestitial renal fibrosis in young woman associ-ation w ith slimm ing regimen including Chinese herbs[J].Lancet,1993,341(13):387．

[4]李锋,程庆砾.对13例木通中毒导致急性肾功能衰竭的分析[J].中国中药杂志,1999,24(7):435．

[5]吴立明.谈朱砂的功用及毒性[J].时珍国医国药,2006,17(3):449-450．

[6]宋广舜,王绍汉,李玉.环境医学[M].天津:天津科技出版社,1987:46．

[7]钱建明.合理使用朱砂谨防汞中毒危害[J].中国民族医药杂志,2003,11(3):18-19.

[8]廖自基.微量元素的环境化学及生物效应(第1版)[M].北京:中国环境科学出版社,1992:347．

[9]对外贸易经济合作部.药用植物及制剂进出口绿色行业标准[S].2001.

[10]应旭辉.藏药二十五味珊瑚丸化学成分分析及神经护作用物质基础研究[D].天津:南开大学,2014.

Determ ination of Aristolochic Acids A and Heavy M etals in Tibetan medicine--ErshiwuweiShanhuwan

Liu Feng-ling①LiZi-xuan②N ie Li-juan③Axia-Arbu④Yuan Rui-ying⑤W ang Ju-le⑥
(①Heze Housekeeping Institute,Heze 274300,China;②③④⑤⑥MedicalCollegeof TibetUniversity,Lhasa 850000,China)

The phenomenon ofmixing useing between Saussurea lappa in the Ershiwuweiprescription and radix aristolochiae in aristolochic acid existed in their utilization and circulation.The article established amethod of RP-HPLC(Mobile phase:Methanol-0.05%Glacialacetic acid 62-38%;detection wavelength:250nm;Column temperature:30℃;flow rate:was 1.0ml/min)and detected the contend of Aristolochic Acids A in prescription, and the secondmethod for inspection ofheavymetal from"Chinese Pharmacopoeia"2010 edition and titration of Ammonium thiocyanatewere used to detect the contentsof totalheavymetals andmercury sulfide in Ershiwuwei Shanhuwan.The solublemercury saltswas inspected with general identification testand controlled its quality to ensure the safety of clinical application.Aristolochic acid A and solublemercury saltswere not detected in the sample,but the total contentofheavymetalswasbetween 200～225ppm,the average contentofmercury sulfide was29.75mg/g and RSDwas 0.56%.The resultshowed that the source of Saussurea lappa controlled well in the Ershiwuwei Shanhuwan but the total contentof heavymetalswas high.Therefore,it is necessary further analysis to detectwhether it is the active ingredientof the productor toxic substances.In this study,ammonium thiocya⁃nate titrationmethed used for testing the contentofmercuric sulfide is very simple and reproduciblewith accu⁃rate result,and itcan beused for controlingquality of ErshiwuweiShanhuwan.

ErshiwuweiShanhuwan;Aristolochic Acids;Heavy Metal;Mercury salts

10.16249/j.cnki.54-1034/c.2015.02.011

R291.4

A

1005-5738(2015)02-065-06

[责任编辑：张建伟]

2015-06-12

刘凤玲，女，汉族，山东单县人，菏泽家政职业学院高级讲师，主要研究方向为分析化学。