银耳干品的DNA提取及随机扩增多态性分 析

王凡华，马务迢，谭庆云，刘伟贤，孙 恬，杜 冰，杨公明，易继财,*

（1.华南农业大学生命科学学院，广东省普通高等学校植物功能基因组与生物技术重点实验室，广东 广州 510642；2.无限极（中国）有限公司，广东 江门 529156；3.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

银耳干品的DNA提取及随机扩增多态性分 析

王凡华1，马务迢2，谭庆云1，刘伟贤2，孙 恬2，杜 冰3，杨公明3，易继财1,*

（1.华南农业大学生命科学学院，广东省普通高等学校植物功能基因组与生物技术重点实验室，广东 广州 510642；2.无限极（中国）有限公司，广东 江门 529156；3.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

银耳子实体中因含有大量的多糖和蛋白质，严重干扰其基因组DNA的提取。本实验建立一种银耳干品（子实体）中DNA的提取方法，利用此法可直接以银耳干品为材料提取DNA，不需芽孢分离和菌丝培养步骤，而且DNA产量高、质量好，可用于随机扩增多态性（random amplified poly morphic，RAPD）DNA分析。RAPD分析的结果显示，本实验所选取的银耳样品间存在DNA多态性。研究结果将有助于当前食品分析检测中直接以银耳干品为材料进行DNA提取及品种鉴别等分析工作。

银耳干品；DNA提取；随机扩增多态性DNA；品种鉴别

银耳（Tremella fuciformis Berk.）又称白木耳，为我国传统名贵食用菌。现代研究[1-3]表明，银耳富含多糖及其它营养活性成分，具有提高人体免疫力、延缓衰老及抗肿瘤等多种作用。随着人们生活水平不断提高，保健意识逐渐加强，人们对银耳的需求也逐年增加[4]。

在银耳实际生产中，商家往往出于商业利益随意更改菌名而导致的“同名异种”和“同种异名”问题较严重，同时也出现由于长期人工选择及地区间引种导致银耳的遗传背景越来越单一及品种退化的问题，从而要求对银耳种质、遗传多样性和亲缘关系进行准确鉴定[5-6]。此外，在银耳的栽培中，目前以棉籽壳为主要原料，而我国棉花种植面积中约70%都是抗虫转基因棉花[7]，使用转基因棉籽壳种植银耳已是很难避免的问题。银耳生长过程中，菌丝附着在棉籽壳上吸收大量水分和养料，那么棉籽壳中的转基因成分是否随水分和养料的运输向银耳子实体飘移而造成转基因生物安全性问题是目前迫切需要研究的课题[8-10]。通过对银耳干品的DNA进行以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术为基础的分子标记鉴定及转基因成分检测是解决目前这些问题的有效方法。

银耳属于胶质菌，其子实体由数片薄而多皱褶的扁平状瓣片组成，脱水后收缩，呈角质化且硬而脆[1]。根据已有的文献报道[6,8,11]，胶质菌富含多糖和蛋白质，其DNA的提取主要以芽孢或菌丝体为材料，此类方法虽然提取的DNA含量可能高于本研究方法，但需进行芽孢分离或菌丝培养的过程，不仅繁琐，且不能对银耳干品实行检测，而目前尚未见直接以银耳干品为材料进行DNA提取及相关分析的报道。

本研究根据已报道的银耳芽孢或菌丝体DNA的提取方法进行改良和优化，建立一种直接提取银耳耳片（子实体）干品中DNA的方法，无需芽孢分离或菌丝培养的中间步骤，从而为下一步直接对银耳成品进行品种鉴别及转基因成分检测等分析提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

所用材料为福建省古田县的“古田银耳”，当地俗称“黄菇”，分别取自大桥村（样品A）、吉兆村（样品B）及古田县批发市场（样品C）。

质量分数2%十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）抽提液：100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷（trihydroxymethyl aminomethane，Tris）-盐酸（pH 8.0）、50 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-2Na（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、质量分数2% SDS。

质量分数2%溴化十六烷基三甲基铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）抽提液：100 mmol/L Tris-盐酸（pH 8.0）、20 mmol/L EDTA-2Na、1.4 mol/L NaCl、质量分数2% CTAB、质量分数2%聚乙烯吡咯烷酮（poly vinyl pyrrolidone，PVP）。

质量分数5% CTAB抽提液：100 mmol/L Tris-盐酸（pH 8.0）、20 mmol/L EDTA-2Na、1.4 mol/L NaCl溶液、质量分数5% CTAB、质量分数2% PVP。

脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、Taq DNA聚合酶、DNA分子质量标准品 日本Takara公司；琼脂糖 西班牙Biowest公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

5417R/5810R常温/冷冻离心机 德国Eppendrorf公司；Universal Hood II凝胶成像系统、PowerPacTMBasic型电泳仪 美国Biorad公司；NanoDrop 1000型紫外-可见分光光度计 美国Thermo Scientific公司；E-2369型PCR仪 日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 银耳耳片干品的预处理

用蒸馏水将银耳干品泡发0.5 h，令其充分吸胀，取出晾干或吸水纸吸干表面水分，保存备用。

1.3.2 银耳干品的基因组DNA提取方法

1.3.2.1 SDS法根据唐良华[12]、李刚[13]等方法，并加以改良。称取已泡发处理的1.0 g银耳置于研钵中，加入适量液氮及0.1 g PVP，研磨均匀，然后迅速转入2.0 mL离心管中，立即加入 1 mL 65 ℃预热的质量分数2% SDS抽提液，混匀后置于65 ℃水浴60～90 min（期间间隔5 min摇动1 次）。12 000 r/min离心10 min，吸取上清液至新的离心管中。加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶l，V/V），轻摇15 min，室温静置5 min后12 000 r/min离心10 min，吸取上层水相至新的离心管中。向离心管中加入等体积氯仿-异戊醇（24∶l，V/V），轻摇10 min，室温静置5 min后12 000 r/m in离心10 min，吸取上层水相至新的离心管并加入氯仿 -异戊醇溶液，重复前述操作3～4 次直至水相与有机相之间的中间层无杂质，最后小心吸取上层水相至新的离心管中，按1∶10（V/V）加入3 mol/L NaAc及2 倍体积的无水乙醇，混匀后放置于—20 ℃条件下沉淀30 min。12 000 r/min离心10 min，弃上清液，DNA沉淀用70%乙醇洗涤2 次，打开管盖，室温放置15 min。待酒精挥发完全后，向管中加入50 μL含10 mg/mL RNA酶A的Tris-EDTA溶液，37℃放置30 min溶解DNA，—20 ℃保存备用。

1.3.2.2 质量分数2% CTAB法

根据刘娟[11]、王艺红[14]等方法，并加以改良。称取已泡发处理的1.0 g银耳置于研钵中，加入适量液氮及0.1 g PVP，研磨均匀，然后迅速转入2.0 mL离心管中，立即加入1 mL 65 ℃预热的质量分数2% CTAB抽提液，余下步骤与1.3.2.1节SDS法相同。

1.3.2.3 质量分数5% CTAB法

根据臧金平[15]、白永宏[16]等方法，并加以改良。称取已泡发处理的1.0 g银耳置于研钵中，加入适量液氮及0.1 g PVP，研磨均匀，然后迅速转入2.0 mL离心管中，立即加入1 mL 65℃预热的质量分数5% CTAB，其余步骤与1.3.2.1节SDS法相同。

为提高基因组DNA提取的最终质量浓度，在上述3 种方法中，每个样品适当做3～5 个重复，然后将氯仿-异戊醇溶液纯化步骤后的水相溶液合并沉淀。

1.3.3 DNA质量浓度测定及电泳检测

利用紫外分光光度计测定DNA溶液在波长260 nm和280 nm处的吸光度，计算出A260nm/A280nm比值及DNA质量浓度[11]。实验重复3 次。

取2.0 μL DNA溶液，以质量分数0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量浓度。

1.3.4 RAPD扩增反应

参考汪小全[17]、詹才新[18]等方法，并稍加修改。随机扩增多态性（random amplified polymorphic，RAPD）DNA扩增反应的随机引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列：S1（5’-GTTTCGCTCC-3’）、S2（5’-TCACGTCCAC-3’）和S3（5’-CAAGCGTCAC-3’）。RAPD扩增反应体系：100 ng模板DNA，0.1 μmol/L随机引物，0.1 mmol/L dNTPs，1.0 U Taq酶，最后加ddH2O补齐至总体积为25 μL。RAPD扩增反应参数：94 ℃、5 min；94 ℃、40 s；36 ℃、40 s；72 ℃、1 min；35 个循环；72 ℃、10 min。RAPD扩增反应的产物以质量分数1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 DNA的电泳检测及质量浓度测定

图1 3 种不同方法提取银耳样品A的DNA电泳Fig.1 Electrophoresis of DNA extracted from Tremella fuciformis A by three different methods

从图1可知，3 种方法提取的DNA均无明显的RNA条带，其中质量分数5% CTAB法提取到的银耳DNA条带单一、亮度最高且无严重拖尾，表明此法提取的DNA含量最高，且DNA未发生降解，也无明显的RNA污染。质量分数2% CTAB法提取的DNA电泳虽然也呈单一条带且无拖尾现象，但其亮度比质量分数5% CTAB法低得多。SDS法提取的DNA条带几乎看不到，且DNA溶液黏稠，表明此法提取的DNA不仅含量极少，而且多糖的比例也很高。表1也显示，在3 种提取方法中，质量分数5% CTAB法提取到的DNA质量浓度最高，达到0.165 μg/μL，而且其A260nm/A280nm的比值在1.8～2.0之间，表明其纯度也符合要求；质量分数2% CTAB法提取的DNA纯度虽然符合要求，但是其质量浓度仅为0.015 μg/μL；而SDS法提取的DNA可能由于多糖含量太高，导致无法准确测定其吸光度。

表1 3 种不同方法提取银耳样品A的DNA纯度及质量浓度测定Table1 Concentrations and purities of DNA extracted from Tremella fuciformismis A by three different methods s

结果表明，由于银耳耳片胶质物含量太高，导致SDS法未能从银耳子实体干品中抽提出DNA；质量分数2% CTAB法虽可抽提出DNA，但得到的DNA质量浓度非常低；而利用质量分数5% CTAB法提取的银耳DNA不仅质量浓度最高，而且纯度符合要求，因此采用质量分数5% CTAB法对样品B和样品C进行DNA抽提与检测（图2、表2）。从图2可知，各个银耳样品中抽提的DNA均呈单一清晰条带，无严重拖尾，且无明显的RNA条带，表明DNA均未发生降解，RNA污染也较少。表2显示各个样品的DNA质量浓度在0.098～0.165 μg/μL之间，且A260nm/A280nm比值均在1.8～2.0之间。此结果表明质量分数5% CTAB法适用于各种不同银耳样品干品的DNA提取，且都能得到较高质量的DNA。

图2 质量分数55% CTAB法提取3 种银耳样品的DNAA电泳Fig.2 Electrophoresis of DNA extracted from Tremella fuciformis by 5% CTAB method

表 22 55% CTAB法提取3 个银耳样品的DNA纯度及质量浓度测定Table 2 Conncentrations and puritties of DNA extracted fromTremella fuciformmiiss bbyy 55% CTAB methhoodd

2.2 RAPD DNA分子标记分析

运用RAPD分子标记分析，可检测抽提的基因组DNA质量是否满足PCR扩增的需要，同时可检测样品DNA之间的多态性[19-20]。从图3可知，3 种随机引物对不同样品的DNA均能成功实现RAPD PCR扩增，扩增出的条带大小在500～2 000 bp之间，而且经3 次以上重复，所有引物对每个样品DNA扩增均能得到1～3 条清晰的主带，表明质量分数5% CTAB法抽提的DNA质量较好，能够满足以PCR技术为基础的RAPD分析需求。此外，从图3可知，每种引物扩增，3 个银耳样品DNA的条带数都不相同，表明这3 个银耳样品间存在DNA多态性，此结果表明，本实验所选银耳样品虽然都是“古田银耳”，但是可能因为不同种植地点的DNA变异积累不同或者遗传本质上属于不同的品种，导致银耳样品基因组DNA间存在RAPD多态性。

图3 不同银耳样品DNA的RAPDD分析Fig.3 RAPD analysis of DNA extracted from different Tremella fuciformis samples

3 结论与讨论

本研究根据文献报道及银耳子实体的特点，建立了3 种直接从银耳耳片（子实体）干品中提取DNA的方法，并对其抽提DNA的效果进行比较，结果表明质量分数5% CTAB法提取的银耳DNA质量最好，利用此法提取的各种银耳样品的DNA均能适用于RAPD扩增反应。

银耳中因胶质物（主要为多糖和蛋白质）含量太多，导致难以从中提取出高质量的DNA，因此前人一般先通过分离和培养银耳的芽孢或菌丝，然后从中提取DNA[5,11]。本研究中质量分数5% CTAB法，主要在以下方面进行了改进：

1）由于银耳干品加石英砂很难保证研磨充分、加液氮冷冻后反而更难研磨，本研究经过摸索发现，将银耳干品泡发0.5 h后再加入液氮冷冻研磨，可保证银耳组织研磨充分均匀；2）在研磨时就加入PVP，使得PVP及早结合酚类物质[21]，减少多酚类物质的干扰；3）CTAB能有效沉淀多糖[22]，因此将抽提液中CTAB的含量提高至质量分数5%，以尽量减少多糖的干扰；4）通过将样品多个重复的DNA溶液合并及再纯化，以提高最终DNA的含量和纯度，保证RAPD扩增反应等分子分析的顺利进行。

通过以上措施，尽量避免胶质物的干扰，可抽提出高质量DNA。本实验方法不仅适用于银耳子实体干品中DNA的提取，也可为银耳新鲜子实体及其他胶质菌子实体中DNA的提取提供参考。

银耳子实体的形态分化较简单，以形态特征为依据进行菌株或品种的区分较困难，商业利益的驱动也常导致“同名异种”和“同种异名”的现象较严重[23-24]。本研究对古田县3 个不同地点采集的“古田银耳”（当地俗称“黄菇”）进行了RAPD分子标记初步分析，发现3 个银耳样品的基因组DNA间存在多态性，显示不同样品的DNA碱基序列存在差异，证明当地银耳品种间的遗传背景可能有差异，可能存在“同名异种”问题。此外，本研究报道的方法可直接从银耳子实体干品提取DNA，即可实现随时取样随时提取DNA便于分析检测，从而满足当前食品分析检测中要求以银耳成品（干品）为材料进行品种鉴别，来解决“同种异名”或“同名异种”问题的需要[25]，也可满足目前以棉籽壳为主要栽培料的银耳成品中转基因成分检测的需要。本课题组正利用建立的方法对采集的银耳样品抽提DNA，以进行分子标记分析和转基因成分检测，相关结果将另文发表。

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DNA Extraction for RAPD Analysis of Dried Tremella fuciformis

WANG Fanhua1, MA Wutiao2, TAN Qingyun1, LIU Weixian2, SUN Tian2, DU Bing3, YANG Gongming3, YI Jicai1,*
(1. Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Biotechnology of Guangdong Provincial Higher Education Insititutions, College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. Infinitus (China) Co. Ltd., Jiangmen 529156, China; 3. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

It is difficult to extract genomic DNA from Tremella fuciformis due to the disturbance of abundant polysaccharides and proteins. In this paper, a method is reported to directly extract DNA from dried Tremella fuciformis without spore separation or mycelium culture procedures which enables one to achieve high-quality DNA in a high yield for RAPD (random amplified polymorphic DNA) analysis. The RAPD results indicated the presence of DNA polymorphisms in the tested samples. The results of this study will contribute to DNA extraction and variety identification of dried Tremella fuciformis in food analysis and detection.

dried Tremella fuciformis; DNA extraction; random amplified polymorphic (RAPD) DNA; variety identification

Q7

A

1002-6630（2015）04-0172-04

10.7506/spkx1002-6630-201504033

2014-06-13

无限极（中国）有限公司项目（HPG/2013/05/0604）

王凡华（1992—），女，硕士研究生，研究方向为生化与分子生物学。E-mail：fanhua_wang@sina.cn

*通信作者：易继财（1971—），男，副教授，博士，研究方向为生化与分子生物学。E-mail：jicai@scau.edu.cn