野木瓜注射液HPLC指纹图谱研究

杨毅生　钟瑞建　洪挺　王栋

[摘要] 目的 建立野木瓜注射液HPLC指纹图谱分析方法。 方法 应用反相高效液相色谱法，采用Zorbax SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，以乙腈（A）-0.5%冰醋酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～40min，95%→70% B；40～60min，70%→50% B），流速1.0mL/min，检测波长为326nm，柱温为25℃。 结果 通过指纹图谱相似度评价软件，对35批野木瓜注射液的HPLC指纹图谱进行了相似度计算，结果均>0.90。 结论 该方法简单可行，可用于野木瓜注射液的质量控制与评价。

[关键词] 野木瓜注射液；反相高效液相色谱法；指纹图谱

[中图分类号] R284；R286 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）19-58-04

[Abstract] Objective To establish the HPLC fingerprint analysis for the quality of Yemugua injection. Methods RP-HPLC method was conducted on a Zorbax SB-C18 column（4.6mm×250mm，5μm）with the gradient elution solvent system composed of acetontrile（A） and 0.5% acetic acid （B）（0～40min，95%→70% B；40～60min，70%→50% B）. The flow rate was 1.0mL/min，the detection wavelength was set at 326nm and the column temperature was maintained at 25℃. Results Using special software，we got the HPLC fingerprint similarity of 35 injection and found the similarity>0.90. Conclusion The method is simple and reliable，and it is capable of effectively controlling the quality of Yemugua injection.

[Key words] Yemugua injection；RP-HPLC；Fingerprint

野木瓜注射液为野木瓜经提取制成的灭菌水溶液，为中医临床常用中药注射剂[1]，具有祛风止痛，舒筋活络之功效，用于风邪阻络型三叉神经痛、坐骨神经痛[2-3]。现行质量标准收载于卫生部药品标准中药成方制剂第二十册第328页（标准号：WS3-B-4003-98），采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮（以芦丁计）的含量来评价野木瓜注射液的质量，由于野木瓜注射液是由野木瓜药材通过醇提酸沉，再经碱调pH中性后醇沉制成的注射液，成分复杂，仅以单一指标评价不能全面反映中药注射剂内在质量，指纹图谱是揭示中药内在物质概貌的重要手段。中药指纹图谱是运用现代分析技术对中药化学信息以图（图像）的方式进行表征并加以描述的一种综合的、可量化的化学鉴定手段[4]。现阶段中药的有效成分大多数尚不明确，中药指纹图谱的整体性和模糊性正好适应这一特点[5]，较单一成分的质量控制方法更具有科学性和全面性。整体性是指中药化学成分的整体组成的特性，即图谱应能相对全面、系统地体现中药成分的整体面貌。模糊性是指个体样品本身就存在着未知因素，难以对所有化学成分进行精确的定性、定量分析，故在解决实际问题时应采用模糊数学等手段[6]。经查阅文献，未见有野木瓜注射液指纹图谱的研究报道。本实验采用反相高效液相色谱法建立野木瓜注射液指纹图谱，应用国家药典委员会中药色谱的指纹图谱相似度评价软件，对35批野木瓜注射液的HPLC指纹图谱进行了相似度计算，结果均大于0.90。从多维数字化角度、全方位揭示野木瓜注射液指纹图谱特征和质量变异，实现了对野木瓜注射液数字化的信息质量控制与评价。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪，配有2996二极管阵列检测器、低压四元梯度泵、在线脱气装置、自动进样器、Empower色谱工作站。Milli-Q超纯水仪，Sartorius BP211D电子天平，中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版（国家药典委员会）。

乙腈为色谱纯（MERCK），其他试剂试药为分析纯，超纯水。木犀草素（批号：111520-200201，含量测定用）购自中国药品生物制品检定所。35批野木瓜注射液（江西天施康中药股份有限公司提供11批，分别标记为S1-S11；上海第一生化药业有限责任公司提供13批，分别标记为S12-S24；江西保利制药有限公司提供11批，分别标记为S25-S35）。

2 溶液制备

2.1 参照物溶液的制备

精密称取木犀草素对照品10.5mg，置50mL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取25mL，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为母液；精密量取1mL，置10mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL含木犀草素0.0105mg）。

2.2 供试品溶液的制备

精密量取野木瓜注射液和参照物母液各1mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

3 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Zorbax SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈（A）-0.5%冰醋酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～40min，95%→70% B；40～60min，70%→50% B），流速1.0mL/min，检测波长为326nm，柱温为25℃，进样量20μL。endprint

为选取最佳的检测波长，能较好地检出供试品溶液各成分在上述液相色谱条件下的色谱信息，用PDA二极管阵列检测器在全波段对各色谱峰进行检测考察，发现有3个色谱峰的最大检测波长在326nm附近，因此在试验过程中共比较了220、254、280和326nm四种波长，在这四种检测波长下的HPLC谱图均有多个色谱峰，以检测波长为326nm时色谱峰较多、峰面积大、峰形对称性较好且基线较平。因此选择326nm为指纹图谱检测波长。

精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μL，分别进样测定，记录色谱图见图1。比较保留时间确定供试品色谱图中峰1为木犀草素峰，其理论板数不低于100 000。考察供试品溶液120min色谱图，结果无干扰峰出现，组分在60min内基本洗脱完全（图2）。

4 方法学考察

4.1 精密度试验

精密吸取供试品溶液20μL，连续进样5次测定，所得图谱导入软件进行分析，计算各共有峰相对保留时间的RSD<2%，相对峰面积的RSD除4号峰外，其余均<3%，表明检测系统的精密度合格。

4.2 稳定性试验

取野木瓜注射液，制备成供试品溶液后分别在0、2、4、8、24h进样测定，所得图谱导入软件进行分析，计算各共有峰相对保留时间的RSD<1%，相对峰面积的RSD除4号峰外，其余均<3%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

4.3 重复性试验

取野木瓜注射液5份，分别制备供试品溶液并进样检测，所得图谱导入软件进行分析，结果各共有峰相对保留时间RSD<1%，相对峰面积RSD除10号峰外，其余均<3%，表明本实验方法重复性良好。

5 样品测定及相似度计算

取10批野木瓜注射液（江西天施康中药股份有限公司6批，分别为S1-S6；上海第一生化药业有限责任公司提供2批，分别为S13、S14；江西保利制药有限公司2批，分别为S26、S27），按选定的色谱条件进行测定，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版（国家药典委员会）进行色谱峰的匹配。通过对选定条件下10批野木瓜注射液的液体指纹图谱进行分析比较，可发现10批样品都具有的主要色谱成分峰共有9个，见图3。并生成野木瓜注射液标准指纹图谱，见图4。

用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版考察35批野木瓜注射液样品与标准指纹图谱的相似度，表明相似度均>0.90。见表1。

6 讨论

试验考察了5种流动相系统，梯度洗脱效果明显优于等度洗脱，并对梯度洗脱条件进行了优化，最终确定为文中所述的洗脱条件。在同一台液相色谱仪上，对Kromasil C18（5μm，250mm×4.6mm，MetaChem色谱柱）、Cosmosil C18（5μm，250mm×4.6mm，nacalai色谱柱）、Kromasil 100 C18（5μm，250mm×4.6mm，Kromasil色谱柱）、Zorbax SB C18（5μm，250mm×4.6mm，Agilent色谱柱）四种不同品牌的色谱柱进行了考察比较试验，结果以上四种色谱柱均能使各共有峰得到较好分离，其中以Zorbax SB C18（5μm，250mm×4.6mm，Agilent色谱柱）的效果更好。以同一根Zorbax SB C18（5μm，250mm×4.6mm，Agilent色谱柱），分别在Waters 600_2996_717、Shimadzu 2010AHT、Agilent 1100三种不同品牌的液相色谱仪上进行了考察比较试验，结果以上三种液相色谱仪均能使各共有峰得到较好分离。建立的分离检测条件适用于野木瓜药材、中间体及成品。建立野木瓜注射液指纹图谱有利于更全面的控制和评价该制剂的质量。野木瓜注射液组分分离及活性成分的结构确证是当前一大难题，有待继续研究。

[参考文献]

[1] 中华人民共和国卫生部药品标准.中药成方制剂[M].第二十册.WS3-B-4003-98：328.

[2] 吴波，李祚雯.野木瓜注射液穴位注射治疗坐骨神经痛52例[J].湖北中医杂志，2004，26（2）：48.

[3] 祖木来提，李志东.野木瓜注射液穴位注射配合针灸治疗坐骨神经痛115例[J].新疆中医药，2004，22（4）：29.

[4] 刘军红，廖国玲.中药指纹图谱的研究综述[J].农业科学研究，2009，30（2）：32-34.

[5] 谢培山.色谱指纹图谱分析是中草药质量控制的可行策略[J].中药新药与临床药理，2001，12（3）：141-145.

[6] 李萍，刘耀.中药指纹图谱的研究现状和发展趋势[J].中国药业，2009，18（8）：19-21.

（收稿日期：2015-07-23）endprint