糖尿病微血管形成障碍所涉及的重要组织结构与晚期糖基化终末产物的关系

潘良利 程 飚

（1.广州军区广州总医院整形外科， 广东 广州 510010；2.南方医科大学， 广东 广州 510515）

糖尿病微血管形成障碍所涉及的重要组织结构与晚期糖基化终末产物的关系

潘良利1,2程 飚1,2

（1.广州军区广州总医院整形外科， 广东 广州 510010；2.南方医科大学， 广东 广州 510515）

微血管形成障碍是糖尿病一个重要的继发改变。糖尿病患者体内存在不同程度的微血管形成障碍，因而易出现慢性难愈性创面等诸多并发症。随着我国糖尿病发生率的逐渐上升，微血管形成障碍引起的并发症亦不断增加，不仅严重影响糖尿病患者的生活质量，也给国家医疗开支带来了巨大负担。因此迫切需要探索糖尿病微血管形成障碍的机制及寻找有效的治疗方法。

既往研究发现，晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）可能在糖尿病微血管形成障碍中充当重要角色。AGEs是由蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰等复杂的多步骤反应生成的一组稳定而不可逆的终末产物，其成分与结构较为复杂，是多种不同化合物的总称。目前，还没有用于研究的理想的微血管模型，更多的是在离体条件下研究AGEs对血管内皮细胞的影响，AGEs对于血管其他组分的影响的研究报道较为零散。本文从构成新生微血管的内皮细胞、基底膜和周细胞3个重要结构来阐述糖尿病微血管形成障碍与AGEs的关系。

1 AGEs与内皮（祖）细胞损伤

1.1 AGE-AGE受体（receptors for advanced glycation end products, RAGE）激活核因子-κB (NF-κB)和活化转录因子激活蛋白-1（AP-1）造成内皮细胞损伤 血管形成过程中，内皮细胞从末端微血管出芽，迁移到血管新生部位，并增殖围成管样结构[1]，内皮细胞功能受损或死亡都会阻碍血管生成。AGEs主要通过与内皮细胞表面的结合发挥其生物学效应，AGE-RAGE轴在糖尿病并发症中发挥了重要作用。

AGE-RAGE提高NADPH氧化酶的活性，诱发氧化应激，并通过激活原癌基因ras及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)途径，激活核因子-κB (NF-κB)和活化AP-1[2]。NF-κB和AP-1不仅能生成IL-1α、IL-6、TNF-α等促炎物质，而且能促进内皮素-1、组织因子、血栓调节蛋白、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和一些黏附分子包括内皮黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1等的表达。这些细胞因子能加强内皮细胞的炎症反应，导致内皮细胞氧化性损伤而死亡[2-3]。同时，IL-1α、IL-6、TNF-α又能促进NF-κB的激活、VEGF及活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生[3]。反过来，氧化应激增强亦能增加细胞内AGEs的生成。

1.2 AGE-RAGE介导生成ROS造成内皮细胞损伤 Ando等[4]的研究表明, AGE-RAGE介导生成的ROS通过抑制人主动脉内皮细胞二甲基精氨酸水解酶Ⅱ 的表达及活性，增加内源性一氧化氮合酶（NOS）抑制剂不对称性二甲基精氨酸的生成，导致内皮细胞NO生成减少。NO 是目前已知最重要的内皮细胞衍生的血管舒张因子，是内皮细胞一个重要的保护因子，其减少会导致内皮舒缩障碍。

1.3 AGE-RAGE激活MAPK、蛋白激酶C（PKC）、多元醇信号通路及损害钙通道造成内皮细胞损伤 AGERAGE轴活化后，还会产生大量ROS，激活MAPK（包括ERK、p38MAPK[5]、JNK和ERK5 4个亚型）、PKC和多元醇通路以及损害钙通道，导致内皮细胞严重损伤。

ERK活化能激活缺氧诱生因子-1而促进VEGF的基因转录，促进新生血管形成，增加血管通透性，改变微小血管渗透压，引起组织缺氧；ERK5还可以调节人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）迁移和细胞骨架的重构。在大部分细胞类型，p38MAPK和JNK都产生促凋亡信号；被激活的p38MAPK还能磷酸化内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）的天然抑制分子微囊素-1，微囊素-1被磷酸化后与eNOS的结合能力增强，抑制eNOS的功能，导致NO生成减少[6]。

氧化应激时醛糖还原酶（aldose reductase, AR）被激活，从而激活多元醇途径。细胞内山梨醇和果糖过度堆积，NADH/NAD+比值增高，钠-钾泵活性下降，细胞和组织缺氧，最终损伤内皮细胞。AR与NOS都是以NADPH为辅酶的还原酶，二者呈竞争性抑制，AR的激活引起NADPH大量消耗，使NOS活性低下，NO合成减少。

氧化应激状态下，PKC途径活化；多元醇通路活化以及AGEs和RAGE相互作用也可激活PKC。PKC激活后可抑制eNOS活性，减少NO的产生；激活NF-κB损伤内皮、促进内皮凋亡；促进血管内皮细胞功能障碍标志物内皮素的释放，内皮素在一定程度上参与氧化应激反应和内皮功能紊乱机制；同时，PKC的激活还能促进VEGF的表达，血管新生增多，通透性增加。

AGEs可能通过活性氧家族的生成导致牛主动脉内皮细胞内储存的Ca2+及Ca2+信号剧烈减少来抑制NO的生成[7]。Zhao等[8]的研究显示，AGEs通过强化氧化应激下调大鼠肠系膜动脉内皮细胞K(Ca)3.1 和K(Ca)2.3的表达及损害K(Ca)3.1 和K(Ca)2.3通道以致血管舒张障碍。

1.4 AGEs作用于内皮细胞的其他途径 AGEs可通过修饰细胞蛋白质而影响蛋白生化和物理性能，导致蛋白电荷、疏水性、交联、周转率和弹性的变化，影响细胞黏附能力和通透性[9]；AGEs的重要成分糖基化胶原I能够引起HUVEC自噬水平的增高而诱导其自噬性死亡[10]。

除了氧化应激外，Kowluru[11]发现，AGEs还可以增强视网膜毛细血管内皮细胞内的硝化应激，导致细胞凋亡，NF-κB和caspase-3参与了该过程。氧化应激下，超氧化物和NO反应生成大量过氧亚硝酸盐，诱发硝化应激。其作为一种强氧化剂和硝化物，除了直接损害细胞外，还可能有助于激活信号转导通路，在细胞凋亡中发挥重要作用。

其次，成彩联等[12]通过实验研究发现，AGEs激活内皮细胞的肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS），上调血管生成样蛋白-4（Angptl-4）的表达，Angptl-4可通过多种机制损伤内皮细胞，增加内皮细胞的通透性；作为RAS终末效应分子的血管紧张素-Ⅱ在糖尿病肾病的发病机制中发挥了关键作用[13]，其还能增加AGEs和ROS的生成[14]。AGEs还能直接诱导人主动脉内皮细胞内质网应激，介导内皮细胞凋亡[15]。Wu等[16]研究表明，AGEs通过ROS导致HUVECs内质网应激，引起细胞炎症反应损害细胞。

再有，Guo等[17]研究证明，微血管内皮细胞的连接蛋白膜突蛋白（moesin）作为调节内皮细胞结构和功能变化的重要蛋白，是AGEs介导的信号通路的下游靶分子。Wang 等[18]亦认为moesin参与了AGEs诱导的视网膜血管内皮损伤，且p38MAPK活化能刺激moesin磷酸化，而磷酸化的Moesin参与调节AGEs诱导的人皮肤微血管内皮细胞功能障碍[19]。

因此，AGEs通过直接修饰细胞蛋白质、诱导细胞内高水平氧化应激及硝化应激、激活细胞RAS、诱导细胞内质网应激等多种途径，促使内皮细胞损伤或凋亡（见表1）。1.5 AGEs/AGEs-RAGE损害内皮祖细胞 由于晚期内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）在血管完整性维护、出生后血管生成及受损血管修复中起重要作用，越来越多的人开始关注AGEs对EPCs的作用。AGEs-RAGE诱导的ROS生成增加可以损害EPCs增殖、迁移、黏附、分泌功能及促进EPCs凋亡[20]。通过上调EPCs表面RAGE的表达，AGEs激活ERK 通路。活化后的ERK除了促进EPCs的凋亡，还能导致血管基底膜发生变构，使得EPCs在血管壁的黏附、迁移功能受损[21]。

表1 AGEs/AGE-RAGE对内皮细胞和周细胞的作用途径

综上所述，AGEs不仅能损害内皮细胞功能、促进内皮细胞凋亡，还能诱导内皮祖细胞功能损伤及凋亡从而抑制毛细血管的生成。

2 AGEs与基底膜

基底膜能使内皮细胞和周细胞固定于疏松结缔组织上，为血管生成提供必需的环境。基底膜病变可能会损害基底膜组成蛋白与特定细胞之间的相互作用、内皮细胞-周细胞交联及微血管收缩功能。糖尿病微循环最突出的结构改变之一就是毛细血管基底膜增厚。AGEs化学上是不可逆的，一经形成，则不断沉积于组织中，穿过血管内膜的AGEs还可与管壁骨架蛋白结合，导致微血管基膜增厚；AGEs通过刺激周细胞释放TGF-β和VEGF，使周细胞纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原蛋白和组织金属蛋白酶抑制剂含量增加，进而诱导神经内膜微血管基膜增厚[22]；通过RAGE 和TGF-β1信号通路，AGEs能诱导IV 型胶原过度表达[23]；AGEs沉积于基膜后，可与胶原蛋白和层粘连蛋白发生交联，进而改变基膜的电荷，导致基膜空间结构改变，血管通透性增加。AGEs特异性抑制剂吡哆胺可以抑制糖尿病大鼠视网膜基底膜成分mRNAs的上调而抑制基底膜增厚[24]。

3 AGEs与周细胞

血管形成后期，周细胞聚集到血管内皮细胞周围，包裹这些内皮细胞，新生血管依赖于血管周细胞的包裹才得以稳定和成熟[25]。AGEs诱导的氧化应激在视网膜血管反应中发挥了关键作用，是周细胞丢失最主要的发病机制，而周细胞丢失主要表现为细胞凋亡。AGE-RAGE通过NADPH氧化酶可诱导ROS的产生，从而引起氧化应激，导致周细胞凋亡。Kim等[26]认为该效应与NF-κB及caspase-3的激活有关。反过来，ROS的产生又使周细胞内RAGE mRNA水平增加，进一步加速周细胞凋亡。

Kowluru[11]发现AGEs能增加视网膜毛细血管周细胞内的硝化应激，诱导细胞凋亡。AGEs体外可以抑制牛视网膜周细胞DNA的合成以及诱导凋亡通路中caspase-3的上游信号分子促凋亡蛋白Bax的过度表达从而促进周细胞凋亡，这种效应在RAGE转染的周细胞内更明显[27]，说明AGE-RAGE参与了此过程。AGEs通过活化p38MAPK和JNK激活不同凋亡信号下游的叉头转录因子FOXO1，FOXO1活化后对凋亡基因产生广泛性作用而诱导大约25个促凋亡基因表达，引起视网膜周细胞凋亡[28]。Kim等[29]认为促凋亡细胞因子参与了AGE-RAGE诱导的视网膜周细胞凋亡过程。Stitt 等[30]通过实验证明AGEs修饰的基质可以通过减少血小板源性生长因子介导的存活信号导致视网膜周细胞功能障碍和死亡。另外，AGEs还通过修饰周细胞蛋白质直接损害细胞[9]；AGEs修饰的细胞外基质可以减少周细胞与其的黏附从而降低血管稳定性（见表1）。这些研究结果进一步丰富了AGEs引起周细胞功能障碍和死亡的作用机制。

新生血管依赖于血管周细胞的包裹才能发育成结构和功能正常的血管，周细胞和内皮细胞共同决定和调节新生血管的稳定性。周细胞失能或凋亡可阻碍微血管的生成或降低微血管的稳定性。

4 小 结

综上所述，AGEs可能是通过影响构成毛细血管的主要结构（内皮细胞、基底膜、周细胞）而抑制新生血管生成的。AGEs主要通过两大途径对微血管结构产生损伤：①非受体途径：AGEs直接修饰细胞蛋白质损害细胞；沉积于基膜，与层粘连蛋白和胶原蛋白发生交联，进而改变基膜的电荷和空间结构；直接与管壁骨架蛋白结合，导致微血管基膜增厚。②受体途径：AGEs主要通过与受体结合在糖尿病微血管形成障碍中发挥重要作用。既往对糖尿病微血管形成障碍的研究主要集中在内皮细胞，对微血管另一重要细胞组分的周细胞未加以重视。近年来，随着更多周细胞标记物的发现与应用，周细胞在血管生成、血管成熟和塑型等方面的研究得以深入，其作用和意义也逐步引起关注。甚至一些研究认为，发现于新生血管芽的周细胞在血管生成早期发挥重要乃至主导作用[31]。因此，AGEs对周细胞的作用可能是未来研究糖尿病血管生成障碍的一个重要方向。研究AGEs与糖尿病微血管形成障碍的关系，能帮助我们更清晰地了解糖尿病微血管并发症的发病机制，可以为延缓或减轻糖尿病微血管并发症提供新思路。AGEs在糖尿病微血管生成障碍中的作用机制十分复杂，还有待进一步阐明。

另外，血管生成是创面愈合至关重要的一环，糖尿病患者体内存在不同程度的微血管形成障碍，因而出现糖尿病足、外伤创面经久不愈等慢性难愈创面。已有学者提出，AGEs损伤血管内皮细胞参与了糖尿病足的发生发展过程[32]，而AGEs损伤内皮细胞/周细胞、诱导内皮细胞/周细胞死亡、促进基底膜增厚导致血管生成障碍也可能直接参与了该过程。AGEs与糖尿病慢性难愈性创面的关系还有待进一步研究。

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2015-05-28）

国家重点基础研究发展计划（973）资助项目（2012CB518105）；国家自然科学基金资助项目（81171812，81272105）

程飚，主任医师（E-mail：chengbiaocheng@163.com）