第三代测序细菌基因组DNA提取方法的比较

穰杰+李莉+唐琼+杨琦+何恋+丁学知+夏立秋

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31370116）;国家“973”基础研究计划资助项目（2012CB722301）;国家“863”高技术研究发展计划资助项目（2011AA10A203）;湖南省教育厅重点资助项目（13CY002， 10CY013，12K033）;湖南省2011协同创新中心资助项目（20134486）

*通讯作者，Email：xialq@hunnu.edu.cn（湖南师范大学生命科学学院，微生物分子生物学国家重点实验室培育基地，中国 长沙410081）

摘要为筛选有效提取细菌菌株总DNA的方法，分别采用SDS法、CTABSDS法、试剂盒法和改良试剂盒法对苏云金芽胞杆菌、粘细菌和放线菌进行总DNA的提取、电泳检测、NanoDrop 2000测定、PCR扩增.对放线菌和苏云金芽胞杆菌，用改良试剂盒法所提取的总DNA纯度较高，电泳条带清晰，DNA主带位于23 kb，单位体积菌液所提取到的总DNA较SDS法和CTABSDS法高，能满足下游的PCR扩增等分子操作.对待测样品所做的质检报告也证实样品合格，可用于后续建库、测序.而粘细菌提取到的总DNA由于它们的OD260/230在2.0以下，没有达到第三代测序样品的要求.改良试剂盒法所提取到的总DNA大多数可以满足第三代测序技术样品制备的要求.

关键词第三代测序技术;DNA提取方法;CTABSDS法;改良溶液型试剂盒法

中图分类号Q939.9文献标识码A文章编号10002537（2015）06001407

Comparative Study of Bacterial DNA Extraction Methods

for the Third Generation Sequencing Technology

RANG Jie， LI Li， TANG Qiong， YANG Qi， HE Lian， DING Xuezhi， XIA Liqiu*

（College of Life Sciences， Hunan Normal University，

State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular Biology， Changsha 410081， China）

AbstractTo screen the methods for effectivly extracting bacterial genomic DNA to the genome sequencing sample preparation for the third generation sequencing. The sodium dodecyl sulphate（SDS） extraction method， hexadecyltrimethylammonium bromidesodium dodecyl sulphate（CTABSDS） extraction method， genomic DNA kit extraction method and improved genomic DNA kit extraction method were compared to extract the total DNA from the Bacillus thuringiensis， Myxobacteria and Actinomycetes. Then， the DNA samples were evaluated through the agarose gelelectrophoresis， NanoDrop 2000 analysis， and PCR amplification， respectively. On Actinomycetes and Bacillus thuringiensis， the method based on improved genomic DNA kit extraction could obtain the higher purity DNA. The electrophoretic bands were clear， and main strip was located in the 23 kb. The total DNA content per unit volume extracted is much higher than SDS method and CTABSDS method， which could meet the need of downstream molecular application. The quality inspection report also confirmed the samples qualified， might be used for subsequent library construction and sequencing. However， the myxobateria total DNA extracted can not meet the requirements for the third sequencing sample because of their OD260/360 far below 2.0. The total DNA improved by genomic DNA kit extraction method could fulfill the sequencing technology requirements.

Key wordsThe third sequencing technology; DNA extraction method; CTABSDS method; improved solution genomic DNA kit extraction method

细菌全基因组测序在当今生命科学领域研究中具有非常重要的作用，其测序方法也由早先的Sanger双脱氧法经过第二代高通量测序技术，更新换代为单分子荧光实时测序技术（SelfMonitoring Analysis and Reporting Technology，SMART技术）.该测序方法与第二代测序方法相比展示了无与伦比的优势.例如，第二代测序技术读长较短，对后续的序列拼接、组装以及注释等生物信息学分析带来困难，而且该技术建立在PCR的基础上，所有影响PCR进行的因素（如GC值异常等）都会影响到全基因组测序，这些不足在一定程度上制约了第二代测序技术的应用与发展[13].而第三代测序技术因其采用单分子读取技术，数据读取速度更快，其测序读长也已达到10 kb，降低后续生物信息学分析所带来的困难[4].同时不需要PCR扩增步骤，解除特殊基因组因GC含量的问题无法全部测序的限制，因此这种方法可以检测基因组的原始状态，获得更真实的信息[56].此外，SMART技术还可以对基因组进行特殊分析，如甲基化研究、基因突变鉴定、RNA测序、重复序列和poly结构的测序[711].

虽然SMART技术具有其他测序技术所无法比拟的优势，但是它却对样本DNA的质量有更高的要求.其主要的参考指标有3个：基因组DNA电泳主条带明显且≥23 kb;无明显降解和拖尾现象;OD260/280为1.8～2.0，OD260/230为2.0～2.2.与第二代测序不同的是，SMART测序技术还要考虑OD260/230的比值，因为SMART测序技术是边合成边测序的过程，该过程使用了DNA聚合酶，为了获得读长较长的片段的信息，需要维持DNA聚合酶的稳定性，因此需要尽可能地去掉样品中含有的盐、有机溶剂和其他杂质[6].

目前，国内外许多学者对各种环境微生物多样性进行了研究，建立了各种细菌总DNA提取方法，为提取不同细菌的总DNA提供了参考[6， 12].本研究分别采用SDS法[13]、CTABSDS法[6]、溶液型试剂盒法和改良溶液型试剂盒法对放线菌、苏云金芽胞杆菌和粘细菌进行总DNA的提取，然后对其进行琼脂糖凝胶电泳检测、NanoDrop 2000紫外分光光度计测定.同时设计16S rDNA引物进行PCR扩增，比较PCR产物条带的亮度和特异性.通过实验比较，探索一种能均衡地从细菌中提取高质量基因组DNA的方法，为第三代测序样品的制备及下游的PCR扩增等分子操作奠定基础.

湖南师范大学自然科学学报第38卷第6期穰杰等：第三代测序细菌基因组DNA提取方法的比较1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株本研究所使用的3种菌株如表1所示.

表1供试菌株特性

Tab.1The properties of three strains used in this work

StrainCharacteristicsSourceBacillus thuringiensis 4.0718Bacterium，G+，rhabditiformLab storedMyxobacteria XT2Bacterium，G-，rhabditiform，orangeLab storedActinomycetes YActinomycetes，G+，branching filamentsLab stored1.1.2试剂细菌基因组快速提取试剂盒（溶液型）购自生工生物工程（上海）有限公司;EDTA（乙二胺四乙酸），SDS（十二烷基硫酸钠），CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），乙酸钾，琼脂糖等均购自格林生物科技（长沙）股份有限公司;RNaseA酶，蛋白酶K，DNA相对分子质量标记DL2000，λ DNA/Hind Ⅲ，PCR试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司;其他生化试剂均为国产或进口分析纯试剂.

1.1.3主要仪器设备NanoDrop 2000紫外分光光度计（Thermo Scientific公司），Gel Logic 200凝胶成像系统（柯达公司），Veriti 96 well thermal cycler PCR扩增仪（Applied Biosystems公司），Eppendorf 5415R型台式离心机（德国Eppendorf公司），BioRad powerpac Basic电泳仪（BioRad公司），HZQF160全温振荡培养箱（哈尔滨东联电子技术公司），F3HN00200D型超纯水仪（Millipore公司），DK98Ⅱ电热恒温水浴锅（天津泰斯特公司）.

1.1.4培养基LuriaBertani 培养基（蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2）;TSB培养基（TSB 30 g/L，葡萄糖9 g/L，酵母粉3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，pH 7.2）;Amb培养基（Starch 5 g/L，Tryptone 2.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO4 0.25 g/L，pH 6.8）

1.2方法

1.2.1细菌培养及预处理苏云金芽胞杆菌菌株于30 ℃环境中200 r/min过夜，按1%～2%的体积比接种于含有20 mL LuriaBertani培养基的摇瓶中，30 ℃环境中200 r/min培养2～3 h，然后取1 mL菌液分装于1.5 mL的EP管中，8 000 r/min离心5 min，弃上清，备用.

放线菌于30 ℃环境中280 r/min培养48 h，按10%的体积比接种于含有50 mL TSB培养基的摇瓶中，30 ℃环境中280 r/min培养36 h，然后取1 mL菌液分装于1.5 mL的EP管中，12 000 r/min，离心5 min，弃上清，备用.

粘细菌菌株于30 ℃环境中160 r/min培养48 h，活化，按10%的体积比接种于含有50 mL Amb培养基的摇瓶中，30 ℃环境中160 r/min培养84 h，然后取1 mL菌液分装于1.5 mL的EP管中，8 000 r/min，离心5 min，弃上清，备用.

1.2.2细菌基因组试剂盒提取（溶液型）操作过程按照说明书进行.

1.2.3改良试剂盒提取（溶液型）样品预处理后，进行基因组DNA的提取.（1）每个EP管中加入20 g/L的溶菌酶200 μL，37 ℃振荡温育30 min.（2）加入400 μL Buffer digestion， 6 μL蛋白酶K（终质量浓度200 mg/L），65 ℃孵育1 h（孵育期间振荡几次效果会更好）.（3）在上述溶液中加入RNaseA（终质量浓度50 mg/L），于37 ℃水浴锅孵浴30 min.然后加入200 μL Buffer PB，振荡混匀，-20 ℃冰箱放置5 min.（4）12 000 r/min离心5 min，取上清于一新的EP管中，约600 μL，勿吸入沉淀.（5）加入等体积的异丙醇于EP管中，摇匀，这时溶液中会出现白色丝状物，伴随有黏度很高的液体.（6）用玻璃棒或枪头将白色丝状物挑取到另一装有700 μL异丙醇的EP管中，颠倒几次，静置5 min，12 000 r/min离心2 min，弃上清，这时管底会出现淡黄色或略带有白色的沉淀，此即为DNA.（7）取700 μL 预冷的75%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min离心2 min，弃上清，重复此步骤一次.（8）待乙醇挥发干净后，取适量体积不含EDTA的TE缓冲液溶解DNA（可视情况65 ℃预热5 min，促使DNA溶解），备用.

1.2.4SDS提取参照文献[13～14]有改进，样品预处理后，进行基因组DNA的提取.步骤：（1）每个EP管中加入20 g/L的溶菌酶200 μL，37 ℃振荡孵育30 min.（2）加入2 μL蛋白酶K（终质量浓度为200 mg/L）， 20 μL RNaseA（终质量浓度为50 mg/L），56 ℃孵育1 h（孵育期间振荡几次效果会更好）.（3）加入24.7 μL 20%的SDS（终体积分数为2%），65 ℃水浴2 h.（4）冰上冷却后，加入等体积3 mol/L的醋酸钾（pH 50），颠倒振荡数次后冰上静置10 min，12 000 r/min离心10 min， 取上清于新的EP管中.（5）加入等体积的氯仿和戊二醛混合液（V氯仿∶V戊二醛=24∶1），充分振荡混匀，12 000 r/min 离心10 min，取上清于一新的EP管中，重复一次.（6）上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，12 000 r/min 离心2 min，倒上清.（7）取700 μL 预冷的75%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min离心2 min， 弃上清，重复此步骤一次.（8）待乙醇挥发后，取适量体积不含EDTA的TE缓冲液溶解DNA（可视情况65 ℃预热5 min，促使DNA溶解），备用.

1.2.5CTABSDS提取参照文献[6]有改进，样品预处理后，进行基因组DNA的提取.步骤：（1）每个EP管中加入20 g/L的溶菌酶200 μL，37 ℃振荡温育30 min.（2）加入2 μL蛋白酶K（终质量浓度为200 mg/L）， 20 μL RNaseA（终质量浓度为50 mg/L），56 ℃孵育1 h（孵育期间振荡几次效果会更好）.（3）加入24.7 μL 20%的SDS（终体积分数为2%），65 ℃水浴2 h.（4）6 000 r/min 离心5 min弃沉淀，量上清液体积， 加1/5倍体积的 5×CTAB， 65 ℃继续恒温水浴10 min.冷却后加等体积的氯仿和异戊醇混合液（V氯仿∶V异戊醇=24∶1）， 缓慢倒转离心管使溶液成为乳状并保持几分钟.6 000 r/min离心10 min， 上清液移入另一离心管， 弃蛋白沉淀.重复用氯仿和异戊醇混合液抽提并离心，直到界面清晰为止.（5）上清液移至另一离心管，并加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，12 000 r/min 离心2 min，弃上清.（6）取700 μL 预冷的75%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min离心2 min，弃上清，重复此步骤一次.（7）待乙醇挥发后，取适量体积不含EDTA的TE缓冲液溶解DNA（可视情况65 ℃预热5 min，促使DNA溶解），备用.

1.2.6PCR扩增本研究旨在进行第三代基因组测序样品提取方法比较，故只选择其中一种菌进行PCR验证.以所提取的Actinomycetes Y总DNA为模板，在Veriti 96 well thermal cycler PCR扩增仪上进行16S rRNA基因扩增，所用引物为根据E.coli 16S rRNA基因第8～27位碱基和1510～1492位碱基序列设计的原核生物16S rRNA PCR通用引物（F16：5′ agagtttgatcctggctcag3′; R16：5′acggctaccttgttacgactt3′）[15]，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

PCR扩增体系反应体系（20 μL）： DNA模板，0.6 μL; 10×buffer，2 μL; dNTP Mix， 1.6 μL; F16（10 μmol）， 0.6 μL; R16（10 μmol），0.6 μL; Taq酶， 0.2 μL; ddH2O， 14.4 μL.

PCR反应条件预变性94 ℃，5 min; 变性94 ℃，30 s; 退火57 ℃， 30 s; 延伸72 ℃， 1 min 50 s; 30个循环后，72 ℃保温10 min.

1.2.7DNA检测基因组DNA用0.7%的琼脂糖凝胶以75 V电压电泳1 h，PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶以100 V电压电泳30 min，溴化乙锭（EB）染色，用凝胶成像系统观察并照相.基因组DNA使用Nano Drop 2000紫外分光光度计进行检测，并计算OD260/280，OD260/230的数值.

2结果与分析

2.14种方法提取的3种不同细菌DNA总量和纯度分析

从表2、表3和表4结果可知，本次研究使用4种提取细菌总DNA方法，所提取的细菌总DNA样品OD260/280均在1.8～2.0，表明提取的总DNA纯度较高，蛋白质和RNA的污染极低.而在3种细菌总DNA样品OD260/230分析时，作者发现对于放线菌和苏云金芽胞杆菌，采用试剂盒法提取的总DNA样品其OD260/230无法处于2.0～2.2，其他提取方法所提取到的总DNA样品能够满足测序样品纯度的要求，这说明该基因组试剂盒在去除盐等小分子物质方面效果并不是很好.相反，对于粘细菌，4种提取方法所提取到的总DNA都无法使OD260/230处于2.0～2.2，这说明粘细菌总DNA在提取过程中可能有某些小分子无法通过常规的方法进行纯化，导致A230有很大的吸收值，结果使得OD260/230偏低.

表24种方法提取放线菌总DNA纯度与产量的比较

Tab.2The comparison of purity and yield for Actinomycetes Y total DNA extracted by four kinds of methods

MethodsOD260/280 OD260/280OD260/230 OD260/230Total/μg1.801.7383.73Genomic DNA kit extraction1.921.861.831.7956.051.861.8146.961.852.1056.19Improved genomic DNA kit extraction1.971.902.012.0780.381.882.1054.641.932.0525.301.951.932.002.0539.84SDS extraction1.902.1027.281.922.0935.34SDSCTAB extraction1.931.922.162.1128.191.912.0934.30

表34种方法提取苏云金芽胞杆菌 4.0718 DNA纯度与产量的比较

Tab.3The comparison of purity and yield for B. thuringiensis 4.0718 total DNA extracted by four kinds of methods

MethodsOD260/280 OD260/280OD260/230 OD260/230Total/μg1.822.3021.81Genomic DNA kit extraction1.811.842.232.2623.521.882.2618.481.822.0621.30Improved genomic DNA kit extraction1.811.812.062.0416.231.812.0121.181.992.129.12SDS extraction1.951.912.142.088.361.801.988.121.872.179.16SDSCTAB extraction2.01.922.172.149.121.902.099.56表44种方法提取粘细菌XT2 DNA纯度与产量的比较

Tab.4The comparison of purity and yield for myxobacterium XT2 total DNA extracted by four kinds of methods

MethodsOD260/280 OD260/280OD260/230 OD260/230Total/μg1.891.7917.40Genomic DNA kit extraction1.881.861.861.8517.561.811.8915.921.871.6618.30Improved genomic DNA kit extraction1.951.881.821.7419.801.821.7317.501.971.7012.17SDS extraction1.961.971.621.659.101.991.6313.021.951.718.41SDSCTAB extraction1.931.951.561.6314.871.981.6210.78就单位体积提取到的基因组产量来说，使用试剂盒法和改良的试剂盒法明显比其他两种方法提取的总DNA的量多得多，如表2、表3和表4所示.结合DNA纯度和单位产量这两个指标进行分析，可以得出结论，改良试剂盒法在进行第三代基因组DNA样品提取时具有明显的优势.

2.23种细菌基因组总DNA的电泳检测

分别采用溶液型试剂盒、改良溶液型试剂盒、SDS和CTABSDS方法对苏云金芽胞杆菌、粘细菌和放线菌提取的总DNA用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳检测，点样量为100 ng，λDNA/Hind Ⅲ DNA Marker 3 μL.凝胶电泳检测结果见图1、图2和图3.

M：λDNA/Hind Ⅲ DNA Marker; 1， 2， 3， 4：Total DNA of Actinomycetes Y by DNA kit extraction， improved DNA kit extraction， SDS extraction and CTABSDS extraction， respectively.

图1不同方法提取放线菌总DNA的电泳

Fig.1Electrophoresis of Actinomycetes Y total DNA for different extraction methodsM：λDNA/Hind Ⅲ DNA Marker; 1， 2， 3， 4：Total DNA of B. thuringiensis strain by DNA kit extraction， improved DNA kit extraction， SDS extraction and CTABSDS extraction， respectively.