复合氨基酸制剂和8周递增负荷有氧运动对大鼠脑组织的保护作用

通讯作者，Email：hehong6819@126.com，姚水玲3，胡文忠1，林正豪1，刘龙成1，范晓星1（1.湖南师范大学体育学院，中国 长沙410012;2.体适能与运动康复湖南省重点实验室，中国 长沙410012;

3.湖南高尔夫旅游职业学院，中国 常德415900）

摘要通过大鼠递增负荷有氧运动训练模型，并联合给予或分别给予牛磺酸和支链氨基酸制剂，以抗羰基应激防御体系为研究视角，探讨含有氨基生物活性小分子的复合氨基酸制剂对大鼠脑组织的保护作用.8周递增负荷有氧运动联合补充复合氨基酸制剂能显著降低羰基应激损伤，且效果明显优于单独补充牛磺酸或支链氨基酸.

关键词有氧运动;牛磺酸;支链氨基酸;复合氨基酸;羰基应激

中图分类号R872.7文献标识码A文章编号10002537（2015）06002706

Protection of Composite Amino Acid and Eight Weeks

Progressive Loads Aerobic Exercise on Rats Brain Tissue

HE Hong1， 2*， YAO Shuiling3， HU Wenzhong1， LIN Zhenghao1， LIU Longcheng1， FAN Xiaoxing1

（1. College of Physical Education， Hunan Normal University， Changsha 410012， China;

2.Key Laboratory of Physical Fitness and Exercise Rehabilitation of Hunan Province， Changsha 410012， China;

3.Hunan Golf and Tourism College， Changde 415900， China）

AbstractThrough progressive loads aerobic exercise training rat model， from the perspective of anticarbonyl stress defense system， the study focused on the protective effect of exhausted rats which administered in combination before exercise and/or given taurine and branchedchain amino acid formulations containing composite amino acids with bioactive small molecules on brain tissue in rats. 8week progressive loads aerobic exercise on treadmill with supplement composite amino acid significantly decreased the damages of carbonyl stress and exhibited better performance than exclusive use of taurine or branchedchain amino acids.

Key wordsaerobic exercise; taurine; branchedchain amino acid; composite amino acid; carbonyl stress

众所周知，氨基酸常被认为是能量物质，而支链氨基酸作为必需氨基酸，不仅是合成机体蛋白质的必需成分，而且还具有显著的抗疲劳作用[12];而牛磺酸通过抗氧化、维持膜稳定、调节渗透平衡等达到抗运动性疲劳的目的[37].有研究表明以L精氨酸为主要成分的氨基酸制剂对提高成绩和改善训练时运动员的身体状况具有明显作用[8]，但其对机体的抗疲劳和保护作用机制尚不清楚.运动引起的心理疲劳是当前运动医学的研究热点之一，根据羰基毒化理论，寻求安全有效的抗氧化剂和羰基类物质清除剂以对抗运动性疲劳已经引起人们的广泛关注[914].本研究根据运动前后氧化应激作用和氨基酸浓度变化的特点，采用含有氨基生物活性小分子的复合氨基酸制剂，联合8周递增负荷有氧运动训练的方法，从抗羰基应激防御体系的角度，探讨复合氨基酸制剂对力竭运动后大鼠脑组织的保护作用，以期为氨基酸抗运动性疲劳机制提供实验依据.

1材料与方法

1.1实验对象及分组

健康雄性2月龄SpragueDawley大鼠40只，体质量为200±15 g，由湖南斯莱克景达公司提供（许可证号：动物SCXK（湘）20090004，饲料SCXK（湘）20090009）.用国家标准啮齿类动物饲料饲养，常规分笼喂养，自由饮水进食，室温保持20～23 ℃，相对湿度为45%～55%，每两天换一次垫料，动物房隔天用消毒液消毒.适应性喂养1周后，将大鼠随机分为5组（见表1）.每组8只，所有运动组大鼠进行8周递增负荷有氧运动训练.

湖南师范大学自然科学学报第38卷第6期贺洪等：复合氨基酸制剂和8周递增负荷有氧运动对大鼠脑组织的保护作用表1大鼠分组、给药方式及剂量一览表

Tab.1Rat groups of administration method and doses

组别n施加因素处理安静对照组（C）8灌胃生理盐水 0.1 mL/10 g 体质量，每天运动前1 h灌胃一次（下同）不运动，正常条件下饲养，与运动组同时取材运动对照组（S）8灌胃生理盐水 0.1 mL/10 g 体质量，并进行递增负荷有氧运动有氧运动训练8周，最后一次运动至力竭后取材运动+牛磺酸组（ST）8灌胃牛磺酸0.1 mL/10 g 体质量，并进行递增负荷有氧运动有氧运动训练8周，最后一次运动至力竭后取材运动+支链氨基酸组（SB）8灌胃支链氨基酸0.1 mL/10 g 体质量，并进行递增负荷有氧运动有氧运动训练8周，最后一次运动至力竭后取材运动+复合氨基酸制剂组（STB）8灌胃复合氨基酸制剂0.1 mL/10 g体质量，并进行递增负荷有氧运动有氧运动训练8周，最后一次运动至力竭后取材1.2实验方案

1.2.1给药方案每次运动前1 h，运动+支链氨基酸组（SB）灌服支链氨基酸（亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸，等物质的量）溶液2 mL[15];运动+牛磺酸组（ST）灌服牛磺酸溶液2 mL[1619];运动+复合氨基酸制剂组（STB）灌服复合氨基酸制剂（牛磺酸+亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸，等物质的量）溶液2 mL.为排除灌胃刺激对实验大鼠的影响，安静对照组（C）与运动对照组（S）均同时灌服等体积的生理盐水.

1.2.2运动方案大鼠递增负荷有氧运动训练方案，参考并改良了郑澜[2021]等有氧运动模型，方案见表2.

表2大鼠8周递增负荷有氧运动方案（速度×持续时间）

Tab.2Eight weeks progressive loads training protocol for rats （Velocity × Duration）

Week星期一星期二星期三星期四星期五星期六星期日1st 15×2515×2515×2516×2516×2516×25休息2nd17×2517×2517×2518×2518×2518×25休息3rd19×3019×3019×3020×3020×3020×30休息4th21×3521×3521×3522×3522×3522×35休息5th23×4023×4023×4024×4024×4024×40休息6th25×4525×4525×4525×4525×4525×45休息7th26×4526×4526×4526×4526×4526×45休息8th26×5026×5026×5026×5026×5026×50取材注：速度：m/min;持续时间：min;跑台坡度：10°.

1.3仪器与试剂

主要仪器：低速冷冻离心机（上海市卢湘仪离心机仪器有限公司）;PT动物跑台（浙江省杭州立泰科技有限公司）; Lambda Bio 40 型紫外可见分光光度计（美国PerkinElmer公司）;F4500型荧光分光光度计（日本Hitach公司）.

主要试剂：MDA，SOD，GSHPx，CAT及组织蛋白定量测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;牛磺酸，亮氨酸（Leu），L缬氨酸（Val），L异亮氨酸（Ile）购自上海蓝季科技发展有限公司.

1.4标本制备及检测指标

沿着大鼠第一颈椎处将脊髓剪断，沿着枕骨大孔与大鼠耳缘上缘连线处将颅腔剪开，然后取出完整全脑.置于冰生理盐水中洗净血液，滤纸吸干，分装在5 mL离心管中，迅速投入液氮，将脑组织碾磨成白色粉末，制作10%脑组织匀浆，用低温4 ℃离心机以3 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液测SOD，GSHPx和CAT活性，MDA和羰基化蛋白含量.

1.5脑组织切片制作

用4%多聚甲醛固定后（24 h），用流动水柔和地冲洗30 min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片，H.E.染色，光镜下放大400倍观察脑组织切片病理形态改变.

1.6统计分析

所有数据均采用SPSS16.0统计软件处理，结果用平均数±标准差（±S）表示.组间差异比较采用方差分析，方差齐性检验.方差齐时用LSD法两两比较;方差不齐时用秩和检验进行统计，显著性水平α=0.05.

2实验结果

2.1脑组织光镜观察结果

400倍光镜下C组大鼠脑组织结构清晰完整，神经细胞密集，排列整齐，神经元胞浆丰富，淡染，胞核居中，核仁清楚，正常胶质细胞结构完整，无胶质细胞增生，锥体细胞核大而圆，排列紧密，核仁清晰，细胞质丰富，胞浆无红染，细胞周围间隙致密无水肿（图1A）;S组细胞周围间隙正常，形态规则，可见少量神经细胞消失、稀疏，排列不规则，数量减少，无水肿（图1B）;SB组、ST组和STB组无S组上述变化，与对照组C组类似（见图1C，D和E）.图中箭头所示为神经元细胞，中间阴影部分为核仁.

A：C组大鼠脑组织;B：S组大鼠脑组织;C：SB组大鼠脑组织;D：ST组大鼠脑组织;E：STB组大鼠脑组织

图1实验大鼠脑组织H.E.染色

Fig.1Experimental rats brain tissue H.E. staining2.2大鼠脑组织SOD、GSHPx、CAT酶活性和MDA、羰基化蛋白含量的比较

脑组织SOD活性测试结果显示（见图2a）：ST组、SB组、STB组与C组比较，SOD活性显著升高（P<001）;S组与C组比较，SOD活性显著性增加（P<0.05）.ST组、SB组、STB组与S组比较，SOD活性显著性升高（P<0.05和P<0.01）;STB组SOD活性最高，但与ST组和SB组比较，无统计学意义.

脑组织GSHPx活性测试结果显示（见图2b）：S组、ST组、SB组、STB组与C组相比，GSHPx活性均显著升高（P<0.01）;同时ST组、SB组、STB组与S组比较，GSHPx活性亦显著升高（P<0.05和P<0.01）;STB组与ST组、SB组比较，均有非常显著统计学意义（P<0.01）.

脑组织CAT活性测试结果显示（见图2c）：ST组、SB组、STB组与C组比较，CAT活性显著升高（P<001）;S组与C组无统计学意义.同时ST组、SB组、STB组与S组比较，CAT活性显著升高（P<0.01）;STB组CAT活性最高，与ST组、SB组比较，均具有显著统计学意义（P<0.01和P<0.05）.

脑组织MDA和羰基化蛋白含量测试结果显示（见图3）：S组、ST组、SB组、STB组与C组比较，MDA含量显著降低（P<0.05和P<0.01）;ST组、SB组、STB组与S比较，MDA和羰基化蛋白含量显著降低（P<005和P<001）;STB组MDA含量最低，与ST组、SB组比较，均有显著统计学意义（P<0.05）（见图3a）.羰基化蛋白含量以STB组最低，ST组、SB组、STB组与C组、S组进行比较，均具有显著统计学意义（P<0.01和P<0.05）;S组与C组相比，STB组与ST组、SB组相比，羰基化蛋白含量降低，但无统计学意义（见图3b）.

各组脑组织SOD活性的比较（a）各组脑组织GSHPx活性的比较（b）各组脑组织CAT活性的比较（c）

与C组相比：b.P<0.05;与S组相比：c.P<0.05，d.P<0.01;与SB组相比：e.P<0.05， f.P<001;与ST组相比：g.P<0.05，h.P<001

图2不同组别大鼠脑组织SOD，GSHPx和CAT活性的比较

Fig.2Comparison of the activities of different groups rats of brain tissue SOD， GSHPx and CAT各组脑组织MDA含量的比较（a）各组脑组织羰基化蛋白含量的比较（b）

与C组相比：a.P<0.05，b.P<0.01; 与S组相比：c.P<0.05，d.P<0.01;与SB组相比：e.P<0.05;与ST组相比：g.P<0.05

图3不同组别大鼠脑组织MDA和羰基化蛋白含量的比较

Fig.3Comparison of the contents of groups rats of brain tissue MDA and carbonyl protein3讨论

近年来对运动负荷与脑组织形态两者间关系的研究逐渐深入.有研究表明过度负荷运动会使脑组织缺血缺氧，神经元及神经胶质细胞损伤，从而引起中枢疲劳，运动能力下降[22].一次性力竭运动后的12 h，脑组织结构发生异常变化，大脑皮质结构损伤明显[23].白石等[24]对大鼠8周游泳训练后研究结果与上述一致.牛磺酸对脑组织神经细胞 RNA损伤具有一定的保护作用[25].本研究发现：复合氨基酸制剂能显著提高力竭运动SD大鼠脑组织抗羰基应激损伤能力.

本实验大鼠经8 周递增负荷跑台有氧运动训练后，力竭大鼠脑组织形态学显示：C组大鼠脑组织结构清晰完整，神经细胞密集，排列整齐，神经元胞浆丰富，淡染，胞核居中，核仁清楚，正常胶质细胞结构完整，无胶质细胞增生，锥体细胞核大而圆，排列紧密，核仁清晰，细胞质丰富，胞浆无红染，细胞周围间隙致密无水肿;S组细胞周围间隙正常，形态规则，可见神经细胞稍稀疏，排列不规则，数量减少，无水肿.ST组、SB组和STB组脑组织的形态基本与对照组C组类似.结果表明：补充牛磺酸、支链氨基酸和复合氨基酸制剂均能够明显降低力竭运动大鼠脑组织细微结构氧化应激和羰基应激损伤.

机体中存在多种抗氧化酶和抗氧化物质，确保机体在常态下处于自由基生成与消除的动态平衡之中.力竭运动中自由基急剧增加，而清除自由基的抗氧化相关酶类如SOD，GSHPx和CAT的活性下降，可能与引发脂质过氧化产生的 RCS攻击这些酶蛋白导致其失活有密切关系[26].羰基应激是指体内活性羰基化合物（RCO）大量增生的状态，研究发现羰氨交联反应可能与运动性疲劳密切相关[2728].活性羰基物质具有较长的半寿期.自由基攻击生物大分子形成的中间产物不饱和醛酮，即活性羰基类物质，其缓慢积累是机体疲劳的关键生化机理[28].运动对于活性羰基类物质的应激有双面性，适度的运动可以表现为机体对羰基应激的适应性和机体对羰基应激防御能力的增强，而大强度的运动，将会引起机体运动性疲劳和机体组织的损伤[28].

有研究报道，90 min定量运动组大鼠脑GSHPx，SOD活性升高而对照组下降.长期有氧训练可以清除运动时产生的大量自由基，提高组织抗氧化酶活性，其机理可能是由于在适宜的慢性运动中，抗氧化酶的活性产生适应性的变化使机体内自由基防御体系加强，因此使机体对羰基应激的适应性和防御能力增强.尤春英[29]等研究发现，3周与7周训练组大鼠脑SOD活性均显著高于对照组;李良鸣等[30]研究发现，牛磺酸和耐力训练均能提高脑组织SOD活性，能降低力竭运动时大鼠脑组织脂质过氧化水平;服用支链氨基酸有利于提高机体内抗氧化酶的活性，清除机体的自由基，对运动性疲劳的恢复可能起到积极的作用[3132].本实验大鼠脑组织中，ST组、SB组和STB组SOD、CAT和GSHPx活性显著高于S组和C组（P<005和P<001），S组SOD和GSHPx活性显著高于C组（P<0.05），STB组SOD和GSHPx活性也高于ST组和SB组.结果表明8周递增负荷有氧运动联合服用牛磺酸和/或氨基酸可显著提高脑组织SOD，CAT和GSHPx活性，提示牛磺酸、支链氨基酸和复合氨基酸有提高机体抗氧化酶活性的作用，保护机体减轻受氧化损伤，递增负荷有氧运动也有此效果.本实验结果与前人的研究基本一致，但发现给予复合氨基酸制剂组的效果显著优于单一给予牛磺酸组和支链氨基酸组.

活性羰基类物质引起动物中枢疲劳的最直接的实验证据是MDA经椎管注射入红耳龟，导致红耳龟的脑电受到抑制，出现了类似乙醇中毒疲劳样的脑电变化[33].活性羰基类物质的α醛或酮结构与神经递质之间的羰氨共价交联，是导致机体衰老和疲劳的核心事件[34].活性羰基类物质与氨基酸反应的作用机制，可能是氨基酸中游离的αNH2与活性羰基物质中的α醛或酮共价交联形成相对稳定的化合物在体内过多累积所致.蛋白质羰基化是指蛋白质肽链中的氨基酸在氧化应激的情况下，氨基酸中的氨基与氧化副产物中的羰基发生了羰氨交联反应.8周的递增负荷有氧运动能够使力竭运动大鼠脑组织中ST组、SB组和STB组MDA和羰基化蛋白含量显著低于S组和C组（P<0.05和P<0.01），S组MDA含量显著低于C组（P<005），结果表明有氧运动训练能使机体对羰基应激产生适应，从而减少羰基毒害损伤，增强羰基应激防御能力，Bloomer[35]的研究结果与本实验结果基本一致.而ST组、SB组、STB组与S组比较，MDA和羰基化蛋白含量显著降低（P<0.05和P<0.01）;STB组MDA和羰基化蛋白含量显著低于ST和SB组（P<0.01）.结果表明给予牛磺酸、支链氨基酸和复合氨基酸可显著降低脑组织MDA和羰基化蛋白含量，但递增负荷有氧运动联合给予复合氨基酸制剂效果更显著.实验结果提示：氧化应激可能是导火索，羰基应激是主因，是导致失修性分子损变的分子基础，这反证了复合氨基酸制剂抗运动性疲劳的主要机制之一，可能是通过补充外源性的氨基酸竞争性地与活性羰基类物质发生羰氨反应，从而保护机体免受羰基应激伤害.

4结论

（1） 力竭运动大鼠脑组织H.E.染色形态学观测表明，运动对照组神经细胞稍稀疏，排列不规则，数量减少，但无水肿.运动联合补充牛磺酸、支链氨基酸和复合氨基酸制剂各组神经元细胞密集、排列整齐、细胞周围间隙致密无水肿，其形态结构与安静对照组的相同.

（2） 8周递增负荷有氧运动能明显提高大鼠机体组织SOD，CAT及GSHPx的活性，降低脑组织细胞膜脂质过氧化程度.牛磺酸、支链氨基酸和复合氨基酸制剂均具有抗氧化和去羰基应激作用，能显著减少脑组织中糖基化蛋白的含量，从而减少羰基应激损伤.

（3） 8周递增负荷有氧运动联合补充复合氨基酸制剂能显著提高力竭运动大鼠清除活性羰基类物质的能力，其作用明显优于8周递增负荷有氧运动训练和在有氧训练中联合补充牛磺酸或支链氨基酸.

（4） 氨基酸抗运动性疲劳的主要机制之一，可能是通过补充外源性的氨基酸竞争性地与活性羰基类物质发生羰氨反应，从而保护机体免受羰基应激伤害.

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