微RNA在骨肉瘤中的研究进展

单　喆，胡兆华,田青松(综述)，盛德乔，李新志(审校)

(三峡大学医学院 三峡大学分子生物学研究所，湖北 宜昌 443002)



微RNA在骨肉瘤中的研究进展

单喆△，胡兆华,田青松(综述)，盛德乔※，李新志(审校)

(三峡大学医学院 三峡大学分子生物学研究所，湖北 宜昌 443002)

摘要：微RNA(miRNA)是一类长度为21～23个核苷酸的调控性小RNA分子，通过mRNA剪切和抑制蛋白质翻译两种方式，负性调控其靶基因。miRNA可以调控约50%的蛋白编码基因，并且参与了包括细胞分化、细胞凋亡等在内的多种生理过程。近年来发现，miRNA在肿瘤相关方面发挥重要作用。该文从miRNA在骨肉瘤中的发生发展、侵袭转移、与药物的协同作用及在血液循环当中的应用4个方面予以综述，并对miRNA在骨肉瘤方面的前景进行展望。

关键词：骨肉瘤；微RNA；血液循环

骨肉瘤是一种恶性肿瘤，由于其发生远处转移早，对化疗不反应敏感，患者的5年生存率仅为50%～60%，因此改良现有治疗手段，探索新的治疗方法迫在眉睫[1]。近年来，微RNA(microRNA,miRNA)在肿瘤发生、发展中的作用及用于抗肿瘤治疗的研究已成为热点。越来越多的研究表明，miRNA在骨肉瘤肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等方面发挥了重要的调节作用[2-3]。Gougelet等[4]通过miRNA芯片分析确定了5种miRNA可作为有转移骨肉瘤的诊断指标。现就miRNA在骨肉瘤中的研究进展予以综述。

1miRNA的产生及作用

miRNA是一类可在转录后水平调控基因表达的非编码RNA分子，成熟的miRNA是长度为21～22个核苷酸的单链RNA分子。miRNA基因在细胞核内完成转录，初级转录物裂解成前体分子与一个不完美的茎环结构，前体分子通过输出蛋白5由细胞核转移到细胞质。在细胞质中，前体分子被Dicer裂解为双链RNA分子。所形成的miRNA在蛋白复合体/RNA诱导的沉默复合物作用下，可与成熟信使RNA上任意与之互补的序列结合，从而抑制基因转录和(或)使信使RNA降解而抑制基因表达。miRNA仅与其靶基因3′端非翻译区的特殊位点结合抑制其翻译过程，从而调控基因表达[5-7]。miRNA参与了生物体很多重要的生理功能，其异常表达与肿瘤的发生、发展及侵袭转移密切相关。

2miRNA与骨肉瘤

2.1miRNA与骨肉瘤的发生、发展骨肉瘤的发病机制目前还不清楚，miRNA与肿瘤发生的相关研究为骨肉瘤发病机制的研究提供了新的思路。miR-128根据细胞环境的不同可在不同的肿瘤中发挥致癌基因或抑癌基因的作用[8-11]。Shen等[12]研究发现，与邻近正常组织相比，miR-128在骨肉瘤组织中的表达显著升高；在骨肉瘤细胞系U20S和MG63中，miR-128的过表达可有效促进被反义miR-128抑制的细胞增殖。进一步的研究还发现，miR-128在人骨肉瘤增殖过程中发挥重要作用是通过直接调节蛋白酪氨酸磷酸酶基因/蛋白激酶B信号途径实现的，提示miR-128可能为骨肉瘤的致癌基因，通过抑制其表达可为骨肉瘤的治疗提供新思路。miR-145已被证实在多种肿瘤细胞中呈低表达，而且miR-145作为一种抑癌基因可影响肿瘤细胞的生长。Tang等[13]选取166组骨肉瘤组织及其周围无肿瘤骨组织，通过实时定量聚合酶链反应方法检测miR-145的表达水平，结果显示，与周围无肿瘤骨组织相比，骨肉瘤组织中miR-145表达显著下降。该研究小组将166组标本根据miR-145表达的高低分为两组，统计学分析结果显示：miR-145低表达的患者临床分期处于晚期且多伴有远处转移，且总体生存期和无疾病进展生存期更短；而miR-145高表达的患者多处于临床早期，肿瘤细胞更小，无远处转移，对化疗反应更好，且总体生存期和无疾病进展生存期更长。多变量分析证明，miR-145的低表达是影响预后的一个独立因素。这也是第一次有确切的证据显示miR-145的低表达与肿瘤的侵袭和远处转移相关，miR-145可能成为判断骨肉瘤预后的一个独立的标志物。

miR-34a被发现在骨肉瘤组织及MG-63和SAOS-2细胞系中表达降低，上调其表达可抑制骨肉瘤细胞的增殖[14]。异种移植裸鼠模型的结果显示，转染miR-34a组的裸鼠的肿瘤细胞体积显著小于对照组，证明miR-34a可在活体内发挥肿瘤抑制作用。为探索miR-34a抑制肿瘤生长的机制，该研究小组做了进一步的研究，发现与对照组相比，转染miR-34a组钾离子通道的表达水平显著降低，提示肿瘤抑制剂miR-34a的活性是通过负性调节致癌基因蛋白Eag1介导的[14]。Eag1在肿瘤的发展过程中起重要作用，在活体内及活体外抑制其表达均可抑制骨肉瘤的生长[15-17]。研究显示，Eag1的表达在人类神经母细胞瘤细胞中可通过p53-miR-34-E2F1途径由p53负性调节[18]。抑制Eag1的表达可显著减少肿瘤细胞的增殖，或使其成为骨肉瘤基因治疗潜在的靶点。

2.2miRNA与骨肉瘤的侵袭转移越来越多的证据表明，miRNA不仅参与了骨肉瘤的发生、发展，还与骨肉瘤的侵袭转移有关。Wang等[19]研究发现，骨肉瘤组织和细胞系中miR-335的表达远远低于正常组织，其表达的下调与淋巴转移显著相关。将miR-335转染入MG-63和U2OS可抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移。而且，miR-335可通过结合其3′端非翻译区靶位点，在转录后水平负性调节锌离子相关的RhoA蛋白1基因的表达。ROCK1在很多肿瘤中表达升高，并引起不良预后，其在骨肉瘤组织中的表达与miR-335的表达呈负相关，用干扰小RNA使ROCK1表达下调可抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移，类似于提高miR-335的表达。提示miR-335可能为肿瘤抑制剂，而ROCK1是一潜在的骨肉瘤治疗靶点。另有研究发现，miR-340在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中表达常常是下调的，在骨肉瘤细胞系中使miR-340过表达可显著抑制在体外细胞增殖、迁移和侵袭，在异种移植小鼠模型中抑制肿瘤的生长和转移[20]。ROCK1也是miR-340的靶基因，miR-340过表达可下调ROCK1的表达，表明miR-340可作为肿瘤抑制因子，其在肿瘤组织中的表达下调有助于骨肉瘤的进展和转移。因此，miR-340可能成为骨肉瘤诊断和治疗的靶标。

最近的研究还发现，miR-218在人骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系SAOS-2细胞中低表达，miR-218表达载体转染后发现，SAOS-2细胞增殖被显著抑制，接着用划痕试验分析发现，与对照组相比，转染miR-218的SAOS-2细胞侵袭和转移能力也被显著抑制[21]。miR-218有3个潜在的靶基因，即T细胞淋巴瘤侵袭转移诱因子1、基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9，miR-218表达可抑制其潜在靶基因的表达。

Wang等[22]报道，与无癌变的骨组织相比，骨肉瘤组织中的miR-214水平显著提高，高表达的miR-214通常容易引起巨大肿瘤、远处转移及对化疗不敏感。高表达的miR-214与总体生存期及无疾病进展生存期的缩短有很大联系，多元统计分析证实，miR-214的高表达是愈后生存期缩短的独立因素。

2.3miRNA可增加表柔比星的抗骨肉瘤效应表柔比星广泛用于骨肉瘤的化疗。经过表柔比星处理的骨肉瘤细胞约有40种miRNA表达发生改变，包括在骨肉瘤细胞中表达下调的24种miRNA，而其中低表达的miR-302b，则有可能被表柔比星诱导。Zhang等[23]用不同浓度的表柔比星处理MG-63和SAOS-2细胞24 h，发现表柔比星抑制骨肉瘤细胞增殖呈剂量依赖性，浓度为1×10-3μg/L的表柔比星可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖。在用芯片技术检测的1146种miRNA中，43种成熟miRNA的表达受到显著的影响，与成骨细胞相比，骨肉瘤细胞中的miR-302b水平显著降低，而1×10-3μg/L的表柔比星可显著提高miR-302b在MG-63和SAOS-2细胞中的表达水平。将miR-302b转染到骨肉瘤细胞中发现，与对照组相比，转染了miR-302b的骨肉瘤细胞生长受到显著抑制，表明miR-302b过表达可增强表柔比星的抗骨肉瘤效应。细胞周期分析结果显示，miR-302b可诱导骨肉瘤细胞周期阻滞，这种阻滞是通过下调细胞周期蛋白D1和细胞周期素依赖性激酶2/4表达实现的。miR-302b还可诱导骨肉瘤细胞的凋亡，其是通过激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3及调节磷酸化的AKT、蛋白激酶B和抗凋亡蛋白Bcl-2等凋亡相关蛋白的表达实现的。用表柔比星治疗也可产生类似效果，但miR-302b的抗骨肉瘤效应并不依赖于表柔比星，miR-302b可增强表柔比星的抗骨肉瘤效应，这为骨肉瘤的治疗开辟了新的思路。

3血液循环中miRNA可用于骨肉瘤的早期诊断

miRNA与肿瘤的发生、发展及侵袭转移密切相关，最近研究还发现miRNA出现在血液循环中，使其作为肿瘤的生物标志物成为可能[24]。miR-34家族成员(miR-34a、miR-34b和miR-34c)通过参与p53驱动的细胞凋亡和细胞周期阻滞发挥肿瘤抑制作用[25-27]。Tian等[28]在研究血浆miR-34b/c表达水平和骨肉瘤之间的关系时发现，与健康人群相比，骨肉瘤患者血浆中miR-34b的水平显著降低，而miR-34c水平与骨肉瘤的发生无显著关系，提示miR-34b可能与骨肉瘤的发生、发展联系密切，其作用或为抑癌基因。进一步分析骨肉瘤组织样本miR-34b表达水平，发现与周围正常组织相比，骨肉瘤组织中miR-34b表达水平较低，证实miR-34b在血浆的表达水平与其在病理组织中的表达水平显著相关。从骨肉瘤临床表现分析，有远处转移的患者血浆中miR-34b的表达水平比无远处转移患者显著降低，提示miR-34b在血浆中的表达水平与肿瘤的转移状态显著相关，为早期治疗骨肉瘤及预测远处转移方面提供新的思路。

6种miRNA(miR-21、miR-199-3p、miR-143、miR-34、miR-140及miR-132)在骨肉瘤的发生中起调节作用。Ouyang等[29]取40例骨肉瘤患者及相同数量健康对照者的血浆，用实时定量聚合酶链反应技术测定其miRNA的表达水平，发现miR-21在血液循环中的水平显著升高，而miR-199a-3p和miR-143的水平显著下降。受试者工作特征、工作曲线分析血液循环中骨特异的碱性磷酸酶和miRNA发现，与骨特异的碱性磷酸酶相比，miRNA在骨肉瘤的诊断中是一个更为敏感的指标。在分析80例样本血液循环中的miRNA水平与临床表现的关系时发现，与无远处转移的患者相比，有远处转移患者的miR-21水平显著上升，而miR-143的水平显著下降；组织学分析发现，与非成骨细胞型的患者相比，成骨细胞型患者血液循环中miR-21的水平更高，而miR-199a-3和miR-143的水平显著下降[29]，这些发现为骨肉瘤的早期诊断、判断组织学亚型及是否有转移风险等方面提供了新的方法和途径。

4问题与展望

近年来肿瘤的诊断标准发生了重大的变化，从纯粹基于形态学到现在纳入了免疫学、细胞遗传学和分子生物学方面的应用。虽然众多的研究结果已经证实，miRNA参与骨肉瘤的发生和发展、侵袭和转移，但具体的分子机制仍然需要进一步的研究。由于miRNA的基因靶向治疗有望极大程度地改善骨肉瘤患者的预后，未来可研究以miRNA为基础的输送效率高、治疗效果好且安全系数高的动物模型实验。

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Progress in Research on MicroRNA in Ostersarcoma

SHANZhe,HUZhao-hua,TIANQing-song,SHENGDe-qiao,LIXin-zhi.

(InstituteofMolecularBiology，MedicalScienceCollegeofChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443002，China)

Abstract：MicroRNAs(miRNAs) are a class of regulatory small RNA moleculars of about 21-23 nucleotide in length，which negatively regulate target gene by mRNA splicing and inhibition of protein translation.miRNAs can regulate about 50% of the protein-coding genes，and participate in a variety of physiological processes including cell differentiation and apoptosis.Recent studies have shown that miRNAs are involved in tumor development and are closely associated with the initiation，progression，invasion and metastasis of human osteosarcoma as oncogenes or tumor suppressor genes.Here is to discuss the roles of miRNAs in osteosarcoma from the perspectives of osteosarcoma genesis and development,invasion and metastasis,synergy with medication and their roles in blood circulation,and the future of the field is also prospected.

Key words：Osteosarcoma; MicroRNA; Blood circulation

收稿日期：2014-01-24修回日期：2014-05-27编辑：鲍淑芳

基金项目：国家自然科学基金(81172788)；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目(T201203)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.01.018

中图分类号：R68

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)01-0045-03