转基因小鼠在生命科学中的研究进展

余科科(综述)，汪思应(审校)

(1.上海交通大学附属胸科医院生物样本库，上海 200030； 2.安徽医科大学基础医学院病理生理学教研室，合肥 230032)



转基因小鼠在生命科学中的研究进展

余科科1,2(综述)，汪思应2※(审校)

(1.上海交通大学附属胸科医院生物样本库，上海 200030； 2.安徽医科大学基础医学院病理生理学教研室，合肥 230032)

摘要：基因工程技术的飞速发展，使得利用转基因小鼠动物模型从生物整体上研究基因组的功能得以实现，并且其应用领域越来越广泛。将与疾病相关目的基因插入到与人类基因组高度同源的小鼠基因序列中构建转基因小鼠模型为研究人类疾病的分子机制提供了强有力的工具。传统的转基因技术由于技术受限影响其应用。近年来，新的转基因小鼠技术，如靶向转基因、快速定点转基因技术的应用为生命科学研究提供了更好的平台，将促进其进一步发展。

关键词：转基因小鼠；动物实验模型；生命科学

利用动物模型开展生命科学研究是传统有效的研究方法，转基因动物模型的建立为生命科学研究带来了巨大变化，已成为新兴的、最有效的动物实验模型之一。转基因动物就是通过生物学方法将外源基因整合进受体动物基因组，外源基因随着细胞分裂而增殖，并能稳定地遗传给后代，使动物表达特殊功能或表现特定的形态。基因组分析数据表明，小鼠与人类基因组高度同源，基因相似率达95%，发育过程及生理生化反应基本相同，对环境和药物的代谢改变也非常类似，因此，人类疾病相关动物模型多选择小鼠来开展科学研究[1]。目前国内外基因工程小鼠的制备已经形成了技术平台，在探讨动物遗传改良、器官移植、动物疾病模型、基因功能等领域具有广阔的应用前景。本文就转基因小鼠在生命科学中的研究进展进行综述。

1转基因小鼠动物模型的构建方法

以往对基因的研究多是将特定外源基因导入原核或真核细胞，但单个细胞中的功能研究并不能代表活体中的作用，转基因小鼠实验动物模型就很好地克服了这个问题。整合入动物基因组的外源基因被称为转基因，通过分析该基因和转基因动物的表型，揭示基因的功能。另外，由于小鼠的成本相对较低、孕期较短、繁育方便且拥有大量的近交系品系，使研究结果有较好的可比性，再加上成熟的基因工程改造技术手段，使得转基因小鼠的构建比其他哺乳动物更省时省力[1]。这些都是研究人员多选择小鼠制备实验动物模型的原因。目前最常用的构建转基因小鼠的核心技术是显微注射法，即将目的基因注入受精卵的雄原核，再将受精卵植入假孕小鼠体内，使外源基因与受精卵DNA发生整合，随着小鼠胚胎的生长发育，再以分子生物学方法从新小鼠中筛选出整合有导入基因的小鼠，进一步稳定小鼠品系[2]。这一方法的优势在于：导入外源基因时不需载体、方法简便、基因整合效率较高、转基因容量可达100 kb且实验周期短。缺点是技术操作难度较大且外源基因是以随机插入的方式进入受体基因组即缺乏精确定位；其整合位点及拷贝数量无法人为控制，可出现多拷贝插入形成连环体；或因为插入位点受限，出现位置效应如基因沉默、基因表达水平更改导致小鼠死亡。近年来随着制备技术的发展，逐渐出现了其他方法，如精子载体法、脂质体介导法、受体介导的基因转移、受精卵原核显微注射法、电脉冲法、体细胞核移植法、胚胎干细胞介导、反转录病毒感染法等。并且从单一的显微注射发展成为多种方法融合的技术体系。

自1987年Thomas等[3]根据同源重组的原理以干细胞介导进行的外源基因定点导入整合，称为基因打靶技术；利用基因打靶技术定点灭活一个内源基因，称为基因剔除技术。基因打靶技术是建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术基础上的一种分子生物学技术，能定向改变细胞或生物个体的遗传信息。目前利用条件性基因打靶载体Cre/loxP重组酶系统，实现了动物模型形式多样化，包括目的基因过表达、基因沉默、功能性互补DNA(cDNA)或报告基因插入，以及外源基因的时间特异性表达[4-5]。迄今已成功制作出多种人类疾病模式小鼠，如帕金森病、糖尿病等，成为研究人类相关疾病的重要模型。利用转基因小鼠这一活体动物，研究特定基因的功能及转录调控，得出的结论也具有很高的“真实性”。

除显微注射法和基因打靶技术外，转基因小鼠的常用制备技术还有病毒转染法、转座子制作法和RNA干扰制作法等。其中病毒载体转染的效率高且不受动物种属限制，根据病毒载体不同还可以分为反转录病毒、腺病毒和以人类免疫缺陷病毒1为基础构件的新型病毒-慢病毒。

2生命科学研究中的应用

如今，分子生物学技术不断发展和完善，越来越多的转基因小鼠应用于生命科学研究中。这其中多为建立实验动物模型，即采用遗传学方法在短期内获得与人类某种疾病相似的并能稳定遗传的特殊动物品系。应用最多的为肿瘤疾病模型，即模拟人体环境而建立肿瘤疾病模型。第一只携带显性致癌基因的转基因小鼠模型被称为“oncomice”[6]；另外，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的x蛋白编码基因(HBx)的转基因小鼠由于表达HBx蛋白，能诱导小鼠发生肝癌[7]。与此同时，转基因小鼠模型还可以作为临床应用前靶向治疗的实验平台，即找出促进肿瘤发生、发展为致死性病变的特定的基因或分子。现有研究证实，肿瘤是遗传畸变积累的结果，包括基因融合、基因扩增、基因突变、表观遗传改变(甲基化)及大片段缺失等[8-10]。根据病理形态和临床表现诊断的同一类肿瘤，从分子水平还可以分成许多分子亚型，根据不同的基因改变在临床使用不同的靶向药物治疗[11-12]，真正实现肿瘤的个体化治疗。转基因小鼠模型对研究肿瘤基因特征、肿瘤抑制基因的表达与功能有重要作用。传统的肿瘤模型多是通过化学致癌剂诱导、肿瘤组织移植等方法建立，近年来，已有多种转基因小鼠模型用于肿瘤形成的研究。建立转基因肿瘤小鼠模型的方法主要是：直接将含有癌基因的DNA注入胚胎干细胞，或将抑癌基因从胚胎干细胞中敲除后再注入胚泡。这些转基因肿瘤小鼠模型能很好地模拟体内的病理生理环境及肿瘤发展动态过程，因此对一些癌前病变也可以开展深入的研究。如发现癌前病变的相关致癌基因及抑癌基因并阐明相互之间作用的分子机制，以及评价细胞凋亡、分化、基因的转录调控等生理生化改变是研究各种肿瘤发生机制的有力手段。

近年来，肿瘤血管生成及肿瘤免疫调控理论成为当今肿瘤研究领域的热点，与此相关的调控基因的研究也越来越多。如过表达血管内皮生长因子小鼠致皮肤癌[13]，直接或间接作用于血管生成相关信号转导途径的关键因子，如凝血酶敏感素2缺陷小鼠通过促进血管内皮生长因子过表达致皮肤癌[14]。转基因小鼠模型与人类疾病的相近性，为研究者准确揭示人类肿瘤的发生、发展机制，开展基因治疗等提供了很好的依据。

随着技术水平的发展和逐步成熟，转基因小鼠动物模型的应用范围越来越广，逐渐向着多领域、交叉学科方向发展，除肿瘤模型外，一些常见的多发病，如心血管疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病、遗传性疾病、神经精神性疾病也有转基因动物模型[15-19]。如不同长度的HBV基因片段导入小鼠受精卵，建立多种HBV转基因小鼠，已经广泛用于HBV复制、致病、致癌机制研究，深入探讨免疫耐受发生、诱导和打破免疫耐受，为筛选细胞因子和抗HBV药物、抗病毒生物制剂开发等多个领域。转基因小鼠的应用还体现在药物毒理模型，如短期致癌实验，药物筛选及有效性和有害性评价，药物蛋白的目标性生产，评价具有遗传毒性、非遗传毒性、致癌性和非致癌性化学物质[20]。利用转基因小鼠模型，研究人员可以发现在致癌过程中特定基因的作用并分析化学物-基因的相互作用。采用转基因动物进行短期致癌实验，不仅增加实验结果的准确性、降低假阳性和假阴性率和自发性肿瘤发病率等还可以对化合物致癌作用进行初步测试，也可为致癌性实验提供补充信息[21-23]。

3展望

转基因小鼠技术虽然已经应用于肿瘤研究中，但其成功率还不是很高，常出现胚胎不能着床、流产及新生小鼠死亡等，这可能是因为外源基因的随机插入影响其他重要基因的表达、插入的基因异常表达扰乱小鼠生长发育等[24]，给转基因小鼠的应用带来了阻碍。但是，随着可调控表达系统、基因定位剔除、荧光素酶标记及活体检测技术等的深入发展，进一步促进了转基因小鼠在生命科学等多领域的研究。因此，转基因小鼠作为生命科学研究的一个新体系将会得到越来越广泛的应用，减少不必要的动物浪费、节约时间和资金。活体研究基因表达及调控作用，克服了原来此领域研究的局限性和片面性。

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Research Progress of Transgenic Mice in Life Science

YUKe-ke1,2,WANGSi-ying2.

(1.Biobank,ShanghaiChestHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200030,China; 2.DepartmentofPathophysiology,BasicMedicalCollege,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract:Life sciences,especially cancer research has brought great changes because of transgenic mice.The technical platform for preparation of genetically engineered mice has scaled up both at home and abroad.The technique of transgenic mice provides a powerful tool to study the molecular mechanisms of human disease because there is much genome homology between human and mouse. The application was limited due to some defects in traditional transgenic technology.In recent years, the new technologies such as gene targeting and rapid point of transgenic technology will provide a better platform for life science research and promote its further development.

Key words:Transgenic mice; Experimental animal model; Life science

收稿日期：2013-10-16修回日期：2014-06-09编辑：相丹峰

基金项目：安徽省级高校优秀青年人才基金(2011SQRL059)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.01.009

中图分类号：R33

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)01-0023-02