细胞凋亡在体外循环肺损伤中的研究进展

何 苗综述，张 红审校

0 引 言

体外循环(cardio pulmonary bypass，CPB)后肺损伤是心脏手术最常见的并发症，严重的表现为急性肺损伤(acute lung injury，ALI)或急性呼吸窘迫综合征(acute respiratorydistress syndrome，ARDS)，同时由此导致的肺功能障碍也是体外循环患者死亡的主要原因之一［1-2］。多数学者认为缺血再灌注损伤及全身炎症反应(血液与管道的接触、肝素-鱼精蛋白及内毒素生成等)可能是CPB肺损伤发生的重要原因，但其具体机制目前尚不十分清楚。近年来，细胞凋亡在CPB的发病机制中越来越受到重视，从凋亡的角度来研究CPB相关性肺损伤，有助于进一步揭示其发病机制并通过细胞凋亡的调控为减轻CPB后肺损伤提供新的手段。现将近年的相关研究综述如下。

1 肺组织细胞凋亡

细胞调亡是由多种控制的细胞自主的有序的死亡。与不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，它涉及一系列基因的激活、表达及调控，是适应生存环境而主动争取的一种死亡过程，又称为细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)。细胞凋亡或PCD在细胞更新和受损细胞的清除中起着至关重要的作用，并在多种疾病的病理生理过程中发挥关键作用［3］。细胞凋亡不足或凋亡过度均可引起机体发生相应的病理生理变化，细胞凋亡过度时则会导致过多的组织细胞坏死及相应器官组织的功能障碍。

实验发现，在CPB肺损伤模型中，支气管上皮、肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞等处，出现凋亡样改变，其凋亡率随时间呈上升趋势，提示细胞凋亡可能参与CPB肺损伤的过程［4］。研究证实，在大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeⅡ alveolar epithelial cells，AT-Ⅱ)的培养液中加入CPB患者术后血清，可导致AT-Ⅱ的凋亡率上升，DNA电泳可见明显的DNA碎裂梯带［5］。同时 Aebert等［3］发现，CPB 后患者的血清可明显诱导内皮细胞凋亡，而患者CPB前、肺叶切除术患者及健康志愿者的血清未发现其促内皮细胞凋亡的作用。因此，目前认为CPB后肺组织细胞凋亡的主要是Ⅱ型肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞，而这2种细胞在维持肺脏正常功能中起到重要的作用。

2 CPB肺组织细胞凋亡的诱因

多种因素参与诱导CPB肺组织细胞凋亡的发生，其中氧化应激、缺血再灌注损伤、全身炎症反应是其主要因素。以上因素并不直接引起细胞凋亡，而是通过一定的信号传递方式激活生存与死亡的相关基因，然后激活细胞执行死亡。当肺组织细胞过度凋亡时可导致CPB术后肺功能、生理、生化和组织学的改变，造成气体交换障碍、肺力学的改变及肺水肿［6］。

2.1 氧化应激反应 在细胞凋亡的诸多诱因中氧化应激，尤其是脂质过氧化物与细胞凋亡的发生有密切关系［7］。正常情况下，机体内氧化损伤和抗氧化能力处于动态平衡，而CPB可破坏此平衡，诱发细胞凋亡［8］。CPB期间及术后，交感神经系统及肾素-血管紧张素系统的激活可以导致全身氧化应激增强而诱发和加重肺细胞凋亡。CPB时可通过NADPH氧化酶和NADH氧化酶的作用形成大量的氧自由基，氧自由基的产生和其它代谢产物所导致的氧化性应激可以通过直接裂解DNA、氧化膜脂质或上调凋亡相关调控基因而诱导细胞凋亡［9］。同时肺缺血期间肺缺氧以及再灌注即刻产生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)可导致线粒体膜损伤和细胞色素C的释放，启动caspase介导的PCD或细胞凋亡［10］。再灌注损伤早期，ROS的产生增加也与炎症介质如细胞因子和黏附分子的上调有关，这些细胞因子可引起多形核中性粒细胞(polymorpho-nuclear leukocyte，PMN)的聚集，最终导致炎症反应、血栓形成、补体激活和细胞凋亡［10-11］。Klass等［6］在猪CPB模型中发现，CPB和心脏骤停可激活ROS介导肺组织损伤和肺细胞凋亡;使用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸后可明显减少caspase-3阳性细胞的数量及羟基-2-脱氧鸟苷的水平，减少肺细胞凋亡，减轻CPB后肺损伤。硝基酪氨酸是机体氧化应激的主要标志之一，研究证实硝基酪氨酸的形成与血管功能障碍呈正相关，可能与CPB后肺组织细胞凋亡及肺功能障碍有关［6］。

2.2 肺缺血再灌注损伤(lung ischemia reperfusion injury，LIRI) 现已明确LIRI可诱导肺细胞凋亡［12-13］。实验证实，在肺缺血再灌注组的大鼠肺组织中发现大量的凋亡细胞，而假手术组(仅开胸组)的大鼠肺组织中几乎没有凋亡细胞［14］。LIRI诱导肺细胞凋亡与肺的解剖特殊性有一定关系。肺有2组血液循环系统，包括肺循环及支气管循环。正常情况下，支气管动脉仅提供全肺约1% ～3%的血供;CPB期间，支气管动脉能为肺提供部分血供，但分布不均。CPB期间阻断段腔静脉后肺动脉血供停止，此时肺得不到充分降温，因此处于缺氧和相对高代谢状态，易发生内皮细胞损伤。在肺动脉恢复血供后，富含高张力氧的血液进入肺，导致缺血再灌注损伤。其中，LIRI导致的Na+泵失活与Ca2+超载是引发肺组织细胞凋亡的重要因素［15］。CPB肺缺血过程中易导致Na+泵失活，再灌注后细胞内Ca2+浓度增加，导致钙超载。线粒体是细胞内钙超载攻击的重要靶点，Ca2+依赖性蛋白酶被激活，破坏细胞骨架与细胞膜的完整性，引起能量代谢障碍，膜通透性增加，线粒体内膜和外膜间隙释放细胞色素C和凋亡诱导因子，促进细胞凋亡或坏死。

2.3 全身炎症反应 Kirklin等［16］于20世纪80年代初首次提出CPB诱发全身炎症反应的概念。CPB期间，血液与管道的接触、缺血再灌注损伤、机血回输、血液稀释以及内毒素等因素均可激活补体系统而介导全身炎性反应［2，9］。CPB所导致的全身炎症反应是造成脏器血管内皮功能紊乱和相关器官实质细胞损伤的主要原因之一。CPB引起的炎性反应可引发肺组织细胞凋亡，其中，PMN在肺内的聚集、激活、凋亡延迟和细胞因子是导致CPB后肺组织细胞凋亡的重要因素［17］。

2.3.1 PMN的聚集、激活及凋亡延迟 CPB诱发的炎症反应中，白细胞特别是PMN占据主要地位，它不仅具有化学趋化性，且反应迅速［17］。PMN在肺内聚集、激活及凋亡延迟是CPB后肺细胞凋亡的重要环节，其机制与氧自由基的形成、炎症介质及中性粒细胞弹性蛋白酶的释放有关［18］。活化的PMN可释放超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等氧自由基，直接或间接损伤肺血管内皮细胞，促发其凋亡。许多研究表明，主动脉开放后左-右房出现明显的粒细胞数目差异，说明大量的PMN在肺内聚集，这种现象与C5a诱导、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的趋化及肺循环突然开放有关［19］。

2.3.2 细胞因子 细胞因子是由 、分泌的、能调节细胞功能的小分子多肽。细胞因子可以在多种细胞系中诱导细胞凋亡。其中与CPB肺细胞凋亡密切相关的主要为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)及IL。而肺源性TNF-α的表达及释放增加是诱导CPB后肺组织细胞凋亡的重要因素［20］。TNF-α可直接诱导肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞凋亡以及间接调节单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞的功能。通过支气管或肺动脉灌注TNF-α抗体可有效降低肺组织细胞的凋亡指数，抗细胞凋亡基因Bcl-2蛋白表达明显增加［21］。TNF-α主要通过死亡受体途径诱导肺组织细胞凋亡，TNF-α与肿瘤坏死因子受体结合后，通过Fas相关死亡结构域蛋白使procaspase-8聚集，产生成熟的caspase-8，并激活下游的效应 caspase，致使细胞凋亡［22］。TNF-α 亦可激活线粒体途径诱发细胞凋亡，但其分子机制尚不清楚［23］。

IL亦与CPB后肺细胞凋亡相关。实验证实，CPB后促炎性因子 IL-1、IL-6、IL-8的水平明显增加［9］;通过上调抗炎性细胞因子IL-10的表达，以及下调TNF-a和IL-8的水平，可有效抑制肺组织细胞凋亡，减轻肺损伤［24］。Fischer等［25］在 IL-10 的基因转染模型中也证实，IL-10主要通过抑制凋亡方式改善LIRI，其机制可能是通过抑制炎症和T细胞介导的免疫反应实现。因此，促炎和抗炎细胞因子之间的平衡很大程度上决定了CPB后患者肺功能的状态。

3 调控CPB肺细胞凋亡的分子机制

CPB肺细胞调亡涉及一系列基因的激活、表达及调控，但其确切的调控途径尚无定论。目前认为线粒体通路、死亡受体通路以及内质网通路参与这一过程。而CPB后肺组织细胞内各种凋亡与抗凋亡分子之间的平衡状态可能直接决定细胞的转归和结局。以下分子机制为近年来CPB肺组织细胞凋亡的研究热点。

3.1 Caspase家族 天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶是一类与凋亡密切相关的蛋白水解酶家族，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键，从而导致细胞凋亡，分为起始型 Caspase和执行型Caspase 2大类。起始型Caspase在凋亡信号的作用下被切割激活，激活的起始型 Caspase对执行型Caspase进行切割并使之激活，被激活的执行型Caspase通过对靶蛋白的水解，导致细胞凋亡。Caspase家族主要通过死亡受体通路介导细胞凋亡，也可通过线粒体途径导致DNA损伤致使凋亡的发生，同时caspase-12可协同其他应激分子通过内质网通路介导细胞程序性死亡。Razi等［11］在大鼠LIRI模型中发现，减少caspase-2及caspase-3表达，可显著增加血红素加氧酶-1等抗氧化酶的生成，减少肺泡灌洗液中中性粒细胞数量和炎症因子的水平，降低肺细胞的凋亡指数，减轻LIRI。

3.2 Bcl-2家族 Bcl-2家族控制着线粒体外膜和内膜的通透性，因此是线粒体凋亡途径的主要调控者，它们通过激活一系列下游基因发挥调节凋亡的作用。Bcl-2家族主要分为2类:即抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W 等)及促凋亡蛋白(如 Bax、Bcl-Xs、Bak、Bid等)。其中 Bcl-2和 Bax是其代表性成员，与CPB相关性肺细胞凋亡密切相关，而Bcl-2/Bax比率直接决定了细胞的存亡。Bax与Bcl-2有较高的同源性，Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡，当Bax与Bcl-2形成异源二聚体时则抑制细胞凋亡［26］。研究证实CPB期间，随着肺组织细胞凋亡的上升，肺组织Bax蛋白表达增多，而Bcl-2表达明显减少且Bcl-2/Bax降低，提示Bcl-2家族可能参与CPB肺组织细胞凋亡的过程［15，21］。目前认为，Bcl-2的表达与Fas诱导细胞凋亡有某种程度的偶联，Bcl-2可抑制或阻断Fas介导的凋亡［21］。

3.3 Fas/FasL 死亡因子受体(Fas)/死亡因子配体(FasL)系统是死亡受体通路的经典代表之一，在生理程序性细胞死亡中起着至关重要的作用，并与促炎症反应存在相互作用［27］。Fas属于TNF受体/生长因子受体超家族，FasL是一种属于 TNF家族的Ⅱ型膜蛋白，能与Fas结合，形成死亡诱导信号复合体，介导以caspase-8为主的凋亡反应，最终导致DNA断裂，促使凋亡［28］。虽然表达 Fas的细胞为多见，但表达FasL的细胞不多，因此肺组织细胞是否发生凋亡很大程度上取决于肺组织中是否有FasL的表达。研究显示，FasL在正常兔肺组织中仅有轻微表达，而在CPB过程中表达明显上调，提示Fas/FasL系统的活化可能参与CPB肺细胞凋亡的发生机制［29］。

3.4 PI3K/Akt PI3K/Akt通路广泛存在细胞中，参与细胞生长、增殖、分化及调节的过程。Akt处于该通路的中心环节，是PI3K的直接靶基因，是细胞生长、存活、蛋白质合成、细胞周期调控和细胞凋亡的中介物，是重要的抗凋亡调节因子［30］。许多细胞因子、生长因子和物理刺激等都可通过激活PI3K而使Akt磷酸化，活化的Akt通过多种信号途径影响下游一系列效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的生物学效应。以下几种机制可能与PI3K/Akt信号通路的抗细胞凋亡有关:①使Bad磷酸化:活化的Akt可使Bad的Serl36磷酸化，与14-3-3蛋白结合、与Bcl-xL等解离，使其不能发挥促凋亡作用;同时稳定线粒体膜电位，阻断细胞色素C的释放［31］。②使caspase磷酸化:活化的 Akt可使caspase-9的Serl96位点磷酸化而失去蛋白水解酶的活性，从而抑制其促凋亡作用。③抑制糖原合成酶3的活性，加速细胞凋亡;同时加快糖酵解的速度，使ATP的生成增加抑制细胞凋亡。④活化核转录因子 κB(nuclear factor κB ，NF-κB)，NF-κB 进入细胞核后，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。实验发现PI3K/Akt信号通路与大鼠CPB后肺损伤有关，但其是否涉及调控CPB后肺组织细胞调亡的过程，尚需进一步证实［32］。

除上述分子机制外，有丝分裂原活化的蛋白激酶超家族可能也参与CPB肺细胞凋亡的过程［13，32］。以上分子并不是独立存在的，而是相互联系、相互影响，构成错综复杂的网络，共同调控CPB肺组织细胞凋亡。虽然现已明确细胞凋亡参与了CPB肺损伤的过程，但其地位及机制尚有待明确。

4 结 语

综上所述，肺组织细胞凋亡与CPB肺损伤有密切关系。目前，TNF-α抗体、氧自由基清除剂等在抗CPB肺细胞凋亡中取得突破性的进展，因此深入研究CPB肺细胞凋亡的发生发展及其分子调控机制、探寻其有效的干预方式，对减少CPB后肺部并发症，提高患者的治愈率具有重要意义，并将为临床CPB肺保护发现新的治疗策略和方向。

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