八角茴香中莽草酸不同提取方法的初步研究

陈歆++龚晶晶++彭黎旭

摘 要 莽草酸是抗禽流感特效药达菲的主要原料。本文以天然植物八角茴香（Illicium verum）为原料，使用高效液相色谱仪，采用单因素试验方法，分别以水、乙醇及甲醇为提取液，探讨从八角茴香中提取莽草酸的效率。结果发现，水的提取效率为8.12%、乙醇为6.06%、甲醇为8.86%。从经济和安全角度考虑，认为选择水作为提取液的试验效果好、成本低且安全，且温度为100℃时提取率最高，为9.47%。

关键词 莽草酸 ；八角茴香 ；蒸馏水 ；乙醇 ；甲醇 ；高效液相色谱

分类号 R284.2

Preliminary Study on Extracting Shikimic Acid from Illicium verum

by Different Methods

CHEN Xin1） GONG Jingjing2） PENG Lixu1）

（1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571737；

2 Linchuan No. 1 High School， Fuzhou， Jiangxi 344100）

Abstract The shikimic acid is the main raw materials of Oseltamivir Phosphate ever since the outbreak of avian influenza all over the world. In this paper， we tested the distilled water， ethanol and methanol extraction effect of shikimic acid in Illicium verum by HPLC and single-factor test. The results showed that the extraction effects were 8.12% （distilled water）， 6.06% （ethanol） and 8.86% （methanol）， respectively. However， distilled water was a kind of preferable extraction solvent in the paper because it is less valuable and much safer than the other solvent candidates. The extraction effect was the best up to 9.47 % at 100 ℃ when distilled water was used as a solvent to extract shikimic acid.

Keywords shikimic acid ； Illicium verum ； distilled water ； ethanol ； methanol ； HPLC

莽草酸（Shikimic acid）是一种极性较大的有机酸。自100多年前从植物中提取出以来，人类对莽草酸的研究就一直没有停止过[1-4]。禽流感暴发后，莽草酸作为抗禽流感特效药达菲的主要原料而受到人们关注。莽草酸主要存在于木兰科植物八角茴香（Illicium verum）干燥成熟的果实中，是八角茴香里一种重要的生理活性物质，具有抗菌、抗肿瘤、抗血栓形成等多种药理功能[5-6]。我国有丰富的八角茴香资源，主要分布于福建、广东、广西、云南、贵州及台湾等地[7]。

莽草酸的化学合成方法比较多，主要由奎宁酸合成以及由碳氢化合物合成等[7-13]，但其步骤繁琐，效率也有所偏低。在莽草酸的合成研究上，瑞士的罗氏公司与德国一家生物技术中心合作开发了采用基因重组得到的大肠杆菌来生产莽草酸的方法。其中，罗氏公司制造的达菲的莽草酸三分之二来自八角茴香，三分之一由大肠杆菌提供[14]。但是莽草酸的化学合成成本较高。目前，从天然植物八角茴香中提取莽草酸的效率仍然偏低，其提取工艺各方面仍然需较大改良和完善。因此，本文以天然植物八角茴香为原料，采用不同提取液（水、乙醇及甲醇作为候选溶剂），探讨从八角茴香中提取莽草酸的效率及最佳工艺条件，为莽草酸的高效提取奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料及试剂

八角茴香（采自江西省）、无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、甲醇（分析纯，上海振兴化工一厂）、蒸馏水（海南大学农学院实验室提供）、高氯酸（分析纯，上海桃浦化工厂）等。

1.1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（LC-20AT，日本岛津公司），HH-SB数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂），台式干燥箱（WG-2003SBC，重庆四达实验仪器有限公司），玻璃仪器冷凝回流装置（RE-52AA，巩义市英峪予华仪器厂），精密酸度计（PHS-3C型，上海雷磁仪器厂），分析天平（BS124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司），等。

1.2 方法

1.2.1 试验方法

1.2.1.1 标准溶液配制

水标准溶液配制：称取0.500 7 g莽草酸标准品粉末放于100 mL蒸馏水中，即为5 000 μg/mL，稀释100倍得到50 μg/mL溶液，并以此溶液作为莽草酸的标准储备液。在50 μg/mL储备液中分别取40、30、20、10、5、1 mL放到50 mL容量瓶中，定容后即可得到一系列标准溶：50、40、30、20、10、5、1 μg/mL的标准溶液。充分摇匀，微孔滤膜滤过，使用高效液相色谱仪进行测定。endprint

乙醇标准溶液配制：称取0.251 1 g莽草酸标准品放于50 mL乙醇中，得到502 2 μg/mL的乙醇溶液，稀释100倍即取0.25 mL放入25 mL容量瓶中，即约为50 μg/mL莽草酸的乙醇标准储备液，其浓度为49.22 μg/mL，然后分别配制49.22、39.37、29.53、19.69、9.84 μg/mL的乙醇标准溶液充分摇匀，微孔滤膜滤过，使用高效液相色谱仪进行测定。

甲醇标准溶液配制：精确称取莽草酸标准品0.245 1 g，溶于50 mL甲醇中，稀释100倍，得到莽草酸的标准储备液，浓度为48.04 μg/mL，然后分别配制成3.20、6.08、12.16、24.12、48.04 μg/mL的甲醇标准溶液，充分摇匀，微孔滤膜滤过，使用高效液相色谱仪进行测定。

高效液相色谱仪配有UV检测器（SPD-20A型）。色谱柱：C18-ODS柱156 mm×4.6 mm；移动相：高氯酸溶液pH=2.5（用蒸馏水及精密酸度计调配）。流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL/次。

1.2.1.2 莽草酸样品的提取

取八角茴香粉末3 g（过40目筛），分别添加不同的提取溶剂，每次提取的固液比为1∶20（g∶mL），于60℃加热回流提取1 h，重复提取3次，合并浸提液，用高效液相色谱测定莽草酸的含量。为避免浓度较高容易出现平顶峰，得到的提取液在进入高效液相色谱仪之前还需要稀释100倍。

1.2.1.3 不同提取温度对提取率的影响

取0.5 g八角茴香粉末，以水为提取液，一次回流提取，固液比为1∶20，温度分别设为40、60、80、100℃，时间设定为1 h。测定方法同莽草酸样品的提取。

1.2.2 数据分析

通过Excel 2003与SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

利用高效液相色谱仪对不同溶剂进行测定，通过不同浓度标准溶液的峰高值计算得到水标准溶液标准曲线方程为y=4.072 7x-0.183 3（R2=0.999 9）（图1），乙醇标准溶液标准曲线方程为y=9.900 4x-9.859 6（R2=0.999 2）（图2），甲醇标准溶液标准曲线方程为y=1.774x+8.021 5（R2=0.980 2）（图3）。

2.2 不同溶剂提取莽草酸样品结果

从水提取莽草酸样品溶液高效液相色谱图（图4）中得到峰高值为165.143 mV，将其代入水溶液标准曲线y=4.072 7x-0.183 3，可以得到该提取液稀释100倍后的莽草酸浓度为40.59 μg/mL，经过计算得到莽草酸稀释前的浓度为4 059.38 μg/mL，溶液中莽草酸的质量为0.243 6 g，由此可得水提取法的提取率为8.12%。

将乙醇提取莽草酸样品溶液高效液相色谱图（图5）中的峰高值290.160 mV代入乙醇溶液标准曲线y=9.900 4x-9.859 6。经过计算得到乙醇提取法的提取率为6.06%。甲醇提取莽草酸样品溶液高效液相色谱图（图6），峰高值h=100.180 mV，代入甲醇溶液标准曲线，经过计算提取效率为8.86%。由以上可以看出甲醇溶液的提取率最高，水溶液的提取率其次，而乙醇溶液的提取率最低。由于甲醇毒性大，在实际操作中应尽量避免使用，故本研究选取水溶液作为提取莽草酸样品的最佳溶液。

2.3 提取方法的比较

取3 g左右八角茴香粉末（过40目筛）、回流提取1 h、液固比20∶1、温度60℃、一次提取时，比较3种溶剂的提取效率，水、乙醇和甲醇的莽草酸提取效率分别为8.117%、6.059%和8.857%。

单因素实验结果进行方差分析发现，用水或甲醇作为溶剂2种方法提取总量差异不显著（p>0.05），但都极显著（p<0.01）高于用乙醇作为溶剂时的提取量。由于甲醇有毒性，不利于操作，因此研究认为选择水作为提取莽草酸的溶剂效果较优。

2.4 不同提取温度对提取率的影响

用水作为溶剂来提取八角茴香中的莽草酸时，在其它条件不变的情况下，提取率随温度的升高而缓慢升高，在40℃时，水的提取率为6.32%，在100℃时，水的提取率为9.47%（图7）。

3 讨论与结论

莽草酸对禽流感治疗效果十分良好。如何更好地提取、分离莽草酸仍是基础研究领域的一个难题，仍需科学研究人员进一步摸索和尝试，从而得到高提取率和高纯度的莽草酸。现在市场上获得莽草酸的最主要来源是从八角茴香中提取。已有报道中，采用提取法提取莽草酸的方法大致分为醇提取和水提取两个方法[6]。但是不同文献中所采用的提取方法与步骤可重复性差，偶然性依然较大。因此，对莽草酸提取的研究还是需要大量、可重复性的试验给予验证。

本试验结果表明，莽草酸的提取率由高至低依次是甲醇溶液的提取率8.86%，水溶液的提取率8.12%，而乙醇溶液的提取率6.06%。从提取率来分析，结果表明采用甲醇提莽草酸的效果>水提取效果>乙醇提取效果。若综合考虑提取的安全性和经济性，水作为溶剂的提取效果则优于醇类。在本次试验设定的其它条件不变的情况下，水温度达到100℃时，提取八角茴香中的莽草酸的含量最高，为9.47%。且水作为提取液具有无毒、对环境无污染、成本低及提取效率高等优点。弥补了甲醇-蒸馏水在成本和安全性上的不足，是一种较好的分析方法。

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