46份菌草种质资源PEPC基因的PCR—RFLP多样性分析

梅嘉洺++黄小霞++王咏+朱美兰++林辉++阳宴清+卢运海

摘 要 根据近缘种间同源基因序列保守的原理，设计20对可用于扩增菌草PEPC基因的特异性PCR反应引物。利用PCR-RFLP技术对46份菌草种质资源进行PEPC基因多样性分析。结果表明：12对引物可对供试材料实现有效特异性扩增，PCR产物经限制性核酸内切酶Hae III酶切，在46份材料上共给出176（平均每对引物14.7）个变异类型。UPGMA聚类分析结果表明，材料间遗传相似系数（SM）在0.86～1，在遗传相似系数为0.865时，46份材料可分为四大类群，这表明PCR-RFLP技术可有效用于菌草资源的遗传多样性分析。

关键词 菌草 ；PCR-RFLP ；种质资源 ；PEPC 基因 ；遗传多样性

分类号 S567.2

Polymorphism Analysis of PEPC Gene Family among

46 Juncao Germplasms by PCR-RFLP

MEI Jiaming1，2） HUANG Xiaoxia1，2） WANG Yong1，2）

ZHU Meilan1，2） LIN Hui2） YANG Yanqing1） LU Yunhai1）

（1 College of Crop Science， Fujian Agriculture and Forestry University，

Fuzhou， Fujian 350002；

2 National Engineering Research Center of JUNCAO Technology， Fuzhou， Fujian 350002）

Abstract A total of 20 pairs of specific primers were designed to amplify the phosphoenolpyruvate carboxylase （PEPC） gene family of JUNCAO germplasms. PCR-Restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） technique was applied to study the polymorphism of PEPC gene family among 46 JUNCAO germplasms. The results showed that 12 of 20 primer pairs gave good amplification patterns， and digestion of these PCR products by Hae III gave a total of 176 （14.7 per primer pair in average） different patterns among 46 JUNCAO germplasms. The genetic similarity coefficient （SM） among all accessions was ranged from 0.86 to 1. The 46 JUNCAO germplasms were clustered into 4 groups by UPGMA when genetic similarity coefficient was 0.865. The study indicated that PCR-RFLP technique could be efficiently used for analysis of genetic diversity of JUNCAO germplasms.

Keywords JUNCAO ； PCR-RFLP ； germplasm ； PEPC gene ； genetic polymorphism

菌草（JUNCAO）是指可用于栽培食用菌、药用菌培养基的草本植物[1]，它既包括芒萁、五节芒、类芦、芦竹、芦苇等野生的草本植物，也包括巨菌草、象草、紫象草、香根草、紫花苜蓿、串叶草、绿洲系列芦竹等人工栽培的草本植物，广义的菌草还包括玉米、高粱、甘蔗等作物的茎叶。随着菌草技术（运用菌草栽培食用菌、药用菌和生产菌物饲料、菌物肥料的综合技术）的不断完善和菌草产业的不断壮大，有关菌草种质资源的收集、保存、鉴定和利用工作变得越来越迫切和重要。但由于可用作菌草的植物种类繁多、来源多样，使得菌草种质资源管理存在一定的盲目性和重复性。因而从分子水平上研究菌草种质资源的遗传多样性及建立菌草种质分子鉴定技术非常重要。

C4植物的CO2固定效率比C3植物高很多，原因是C4植物的叶肉细胞中含有独特的酶，即磷酸烯醇式丙酮酸碳羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC4.1.131），它是C4植物光合作用过程中的第一个关键酶，使得由气孔进入空气中的CO2首先被一种三碳化合物——磷酸烯醇式丙酮酸同化，形成四碳化合物草酰乙酸，后者经叶绿体中的苹果酸脱氢酶进而被还原为苹果酸，进入维管束鞘，再分解释放出CO2和一个三碳分子——丙酮酸；CO2进入C3（卡尔文）循环被1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubusco）固定，而丙酮酸则重新被运回叶肉细胞的叶绿体内，在磷酸丙酮酸二激酶的催化下形成CO2受体磷酸烯醇式丙酮酸（图1）。因此，C4植物可在夜晚开放气孔吸收CO2并合成C4化合物，再在白天有阳光时借助C4化合物提供的CO2合成有机物，有利于植物在干旱、低温的环境下保持较高的生物产量[3]。PEPC广泛存在于光合生物（如植物、藻类、蓝细胞和光合细胞）、非光合细菌及原生动物中[4]。编码该酶的基因在甘蔗[5-6]、玉米[7-8]、高粱[9]等C4植物、其它CAM植物及C3植物中被相继克隆并被详细研究[10]。在这些植物中都存在着3～4个编码PEPC的小基因家族，每个家族可包含1至多个基因成员，它们的序列在不同植物之间存在着一定的保守性[2，11-12]。endprint

本研究利用近缘植物中同源基因序列保守的原理，对高粱、玉米、水稻、甘蔗等植物中已知PEPC基因序列进行采集、分析和序列比对，在基因保守区域设计特异性PCR引物，继而用来扩增不同菌草种质资源中的PEPC基因片段，结合PCR-RFLP技术，对获得的PCR产物进行限制性核酸内切酶Hae III酶切，分析其多样性，为科菌草种质资源的分类鉴定及评价提供理论依据和技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的46个菌草材料取自福建农林大学国家菌草工程技术研究中心设立在福州的种质资源圃（表1）。于2014年秋季采集各品种（系）幼嫩叶片，装入编号袋，保存于-80℃冰箱中备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和检测

采用改良CTAB法提取基因组DNA[9]，然后进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的质量，并在Nanodrop 2000（Thermo Fisher）分光光度计上测定DNA样品的浓度。先将浓度稀释至100 ng/mL母液，再取少量配制成浓度为20 ng/mL的备用液。

1.2.2 引物设计

高粱、玉米、水稻、甘蔗等植物的完整PEPC基因序列（mRNA及DNA序列）来自于网上NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），主要有5个高粱序列（Sb02g021090、Sb03g035090、Sb04g008720、Sb07g014960、Sb10g021330）、5个玉米序列（NM_001111968、XM_008657117、NM_001112033、NM_001111948、NM_001112033）、5个水稻序列（AK242583、Os01g0208700、Os01g0758300、Os02g0244700、Os08g0366000）和1个甘蔗序列（M86661）。利用CLUSTALW软件进行序列分析和比对，找出序列之间的保守和差异区域；借助于在线Primer3.0Plus软件（http：//www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/

primer3plus.cgi），在序列保守区域设计特异性PCR引物，由上海生工生物技术有限公司合成。设计的引物预扩增的片段长度在700～1 500 bp。其中用于本研究的12对引物名称及序列见表2。

1.2.3 PCR-RFLP分析

PCR反应总体积为20 μL，其中包括DNA模板（20 ng/μL）2 μL，正向引物（10 μmol/L）1 μL，反向引物（10 μmol/L）1 μL，2xTaq PCR Starmix （GenStar）10 μL，ddH2O 6.0 μL。所用试剂购自北京康润诚生物技术有限公司。PCR反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸1 min，循环35次；随后72℃延伸7 min，最后4℃恒温保存。首先取5 μL PCR扩增液，在1.0%琼脂糖、TAEx1、120 V条件下电泳30 min，在凝胶成像仪（伯乐）上观察结果并拍照。然后取10 μL PCR扩增液，加入1 U的Hae III酶和1xBuffer（宝生物工程有限公司），用ddH2O补至20 μL，放置在37℃恒温箱处理90 min，在1.5%琼脂糖、TAEx1、110 V条件下电泳30 min，在凝胶成像仪上观察结果并拍照。

1.3 统计分析

针对每一对特异性引物，首先对其在46个菌草材料上PCR产物的Hae III酶切电泳图谱进行整体分析比较，鉴定出存在与该46个菌草材料中间的所有变异类型，依次被命名为A、B、C、D、E、F等。然后针对每个变异类型（可被看作一个分子标记）统计其在46个菌草材料中的分布情况：属于该变异类型的记为1，不属于该变异类型的记为0，根据统计的结果建立原始数据（0，1）矩阵。利用NTSYS-pc 2.1软件中的子程序SIMQUAL对矩阵进行样本间的相似性系数（SM）计算，然后用子程序SAHN中的非加权类平均法（UPGMA）进行聚类分析，最后用Tree plot绘制树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 PCR引物的筛选

针对PEPC基因家族的各个成员基因及每个成员基因的不同区域，总共设计了20对引物。这些引物合成后首先在8个菌草种质材料上进行扩增实验（图2），其中12对引物能够在8个材料上扩增出清晰、稳定的条带（如图2中的PEPC01-PEPC05所示），而其余8对引物则给出了不稳定的扩增结果（如图2中的PEPC13所示）。

2.2 遗传多样性分析

利用筛选出的12对引物对46份菌草种质材料进行PCR扩增，并对扩增产物进行Hae III酶切及琼脂糖电泳，结果共鉴定出176个变异类型（限制性内切酶Hae III酶切电泳谱类型），每对引物给出10～17（平均为14.7）个变异类型。引物PEPC03在46份菌草种质材料上的PCR-RFLP分析结果见图3。

2.3 菌草种质的聚类分析

对46份菌草种质材料的PCR-RFLP数据进行UPGMA聚类分析，聚类结果见图4。由图4可知，供试材料之间的遗传相似性系数（SM）分布在0.86～1，在遗传相似系数为0.865时，可将46份菌草种质材料分成I、II、III、IV共四大类群。

第I类群中包括了26份种质，是最大的一个类群，并且所有材料均属于狼尾草属（Pennisetum）植物；其中有3对种质材料（海南象草和细茎象草、漳州象草和热研4号粗茎象草、台湾甜草和高丹草变种）之间的遗传相似系数为1，说明它们的亲缘关系很近，现有数据无法将它们区分开来；8195象草、狼尾草和美洲狼尾草3个材料和其余的23份材料之间有着明显的遗传差异，后者明显可进一步分成几个小组。endprint

第II类群包括了高粱属（Sorghum）、甘蔗属（Saccharum）、薏苡属（Coix）等10份材料，材料之间的遗传多样性比较大（相对于第I类），10份材料均被区分开来。

第III类群包括了所有芦竹属（Arundo）的8份材料，其中绿洲3号和绿洲6号与其余4份材料明显区分开来，说明它们之间的遗传距离相对较远，8份材料均被区分开来。

第IV类群包括了分别属于类芦属（Phragmitas）和类芦属（Neyraudia）的2份材料，两者之间的差异距离相对较大，相似系数为0.88。

3 讨论与结论

PCR-RFLP技术利用特异性PCR引物扩增样本中有关细胞核或细胞质DNA上的特定基因区域，再对扩增产物进行限制性核酸内切酶酶切，结合电泳分析来检测该基因区域内在供试样本之间的遗传变异情况。该技术省时、高效、低成本，已经被成功用于针叶树[14]、橡树[15]、甘蓝[16]、木瓜[17]、桑树[18]等植物来开展遗传多样性分析、分子进化树构建等研究工作，也被作为一项检测技术来鉴别咖啡的种类[19]。

随着菌草产业的蓬勃发展，菌草的种质资源收集工作越来越受到重视[1]。但由于可作为菌草的植物种类繁多、地理来源广泛，目前在种质资源的鉴定、保存、管理和利用等多个环节上还存在着许多盲目性。本研究在46份菌草种质材料上使用PCR-RFLP技术，对特异于C4植物光合作用过程中的第一个关键酶PEPC基因家族的不同成员基因进行了多样性分析，筛选出了12对扩增效果好的PEPC基因特异性PCR引物。聚类分析结果将46份菌草种质材料清楚的分成4大类群，其中的第I大类群包括了供试材料中的所有26份狼尾草属材料，并且可进一步分成几个小组。第III大类群包括了所有的8份芦竹属材料，第II大类群包括了多个属的植物，而第IV大类群却包括了2个属的2份种质。这些结果虽然还不够完善，但为菌草种质资源的鉴定提供了初步的分子依据和技术手段，未来渴望将该项技术在菌草上进一步推广，同时还可以结合采用其它技术，如ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）[20]、SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism）[21]、iPBS（inter Primer Binding Site）[22]等，通过分析更多的菌草种质材料，以获得更加全面的聚类分析结果，为菌草种质资源的收集、管理和利用提供参考和指导。

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