胃肠胰神经内分泌瘤相关微RNA的研究进展

杨　逸(综述)，王志刚(审校)

(上海交通大学附属第六人民普外科，上海 200233)



胃肠胰神经内分泌瘤相关微RNA的研究进展

杨逸△(综述)，王志刚※(审校)

(上海交通大学附属第六人民普外科，上海 200233)

摘要：微RNA(miRNA)是一类具有21～22个核苷酸的非编码小分子RNA，通过在转录后水平调节靶基因的表达，参与细胞的增殖、分化、凋亡等多种生理过程。miRNA具有促癌或抑癌作用，在人类肿瘤的起源与演进过程中起重要作用，充当促癌基因或者抑癌基因作用，是极具敏感性的生物标志物及治疗靶点；相较正常组织，miRNA在胃肠胰神经内分泌瘤中亦存在显著差异表达，具有潜在临床价值。

关键词：微RNA；神经内分泌瘤；胃肠道；胰腺

神经内分泌瘤(neuroendocrine tumors，NETs)是一类起源于内胚层神经内分泌细胞的肿瘤，以胃肠胰NETs(gastroenteropancreatic NETs，GEP-NETs)最常见，发病率逐年上升[1]。GEP-NETs具有广泛的异质性，胃、肠、胰各部位NETs样本量相对不足，导致GEP-NETs的基因学研究未取得突破性进展，同时很多阴性试验提示包括p53、RB1、KRAS等在实体肿瘤中经典的抑癌或促癌基因，在GEP-NETs中却少有明显改变[2-5]。微RNA(microRNA，miRNA)是广泛存在于真核生物中的非编码小分子RNA，自1993年发现以来[6]，截止2014年6月，已有28 645种miRNA被miRBase数据库收录。miRNA扮演促癌或者抑癌基因的角色，通过负性调控各自相应的抑癌或促癌基因，参与肿瘤发生与发展[7]。miRNA参与GEP-NETs起源和进展，并有望成为GEP-NETs诊治过程中重要的生物标记及治疗靶点。现就GEP-NETs相关的miRNA研究进展及临床应用前景进行综述，以期为GEP-NETs的基础研究及临床诊治提供新思路。

1miRNA概述

在细胞核内，编码miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，转录为长链初始miRNA(primary miRNA,pri-miRNA)[8]。研究认为，编码miRNA的基因转录为单顺反子或多顺反子信使RNA(mRNA)，且其转录受到组织特异性主基因的控制，从而保证了miRNA的组织特异性[9]。pri-miRNA经RNaseⅢ内切酶家族的Drosha酶及其辅助因子DiGeorge综合征危象区基因8(DGCR8)识别和切割，生成具有70～90个核苷酸和茎环结构的前体RNA(precursor RNA，pre-RNA)[10]。pre-RNA在RNA-GTP依赖的输出蛋白Exportin-5作用下，从细胞核运输到细胞质，由对双链RNA专一的RNA内切酶Dicer酶剪切成长度为21～22个核苷酸的成熟双链miRNA(miRNA/miRNA*)[11]。双链miRNA(miRNA/miRNA*)继续在Dicer酶的作用下解螺旋，其中一条链(miRNA)结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成非对称RISC，RISC结合到目标mRNA上，通过与特定靶基因mRNA的3′非翻译区完全或不完全互补配对，导致靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻译，从而发挥其对靶基因表达的调控作用[8,12]。以往将双链中与RISC结合的那条链称作主链即miRNA，而所谓的miRNA*在miRNA结合后通常被降解，被视为无功能链。但越来越多的研究表明，miRNA*不是miRNA 生成过程中一条简单的无功能链，它更倾向于作为一条功能链并起重要的生物学作用[13]。研究显示，miRNA 对基因表达的作用机制远比目前预期的复杂。miRNA可通过向富含AU序列的mRNA招募蛋白复合物增加靶基因的转录；或者与阻碍基因转录的蛋白质相互作用，去除靶基因所受的转录抑制，从而间接增加靶蛋白的合成[8,14-15]。此外，部分研究还指出miRNA可通过增强核糖体生物活性促进蛋白质合成，或者在细胞周期停滞的情况下，将其对mRNA的抑制作用转换为激活作用，促进靶基因的转录[14,16]。

2miRNA与人类肿瘤

2002年Calin等[17]首次提出了miRNA与人类肿瘤相关，他们在研究慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)时发现，CLL患者常发生染色体13q14丢失。此染色体片段为非编码基因DLEU2内含子区域，但具有表达miR-15a和miR-16-1的编码基因，多数CLL患者出现miR-15a/16-1的表达下调或缺失，提示其表达与CLL相关。后续研究显示miR-15a/16-1下调原癌基因Bcl-2的表达，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤增殖，miR-15a/16-1在CLL中扮演抑癌基因的角色[18]。miR-15a/16-1抑癌基因的作用还体现在包括小细胞肺癌在内的多种肿瘤中，它的下调或缺失解除了其对原癌基因Bcl-2、BMI1、CCND2及CCND1等的抑制作用，导致肿瘤细胞增殖及疾病进展[19]。

近年来大量研究显示，类似miR-15a/16-1，在正常组织中高表达，在肿瘤组织中低表达或缺失的呈抑癌基因作用的miRNA有miR-34/122/375等；而miR-21/155/195/221等在正常组织中低表达或不表达，在肿瘤组织中高表达，呈现促癌基因作用[17-23]。值得注意的是，miRNA具有明显的组织细胞特异性，相同的miRNA在不同的肿瘤中作用各不同。miR-191 促进A549细胞生长而抑制海拉细胞生长，miR-24促进海拉细胞生长却抑制A549细胞的生长[24]。miR-21通过下调第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)的表达在人肝细胞肝癌中呈现促癌基因功能，但其在人类红白血病中抑制癌基因KIT的表达扮演抑癌基因角色[8,25]。

3miRNA与GEP-NETs

受制于GEP-NETs临床样本不足及细胞株的匮乏，miRNA 在GEP-NETs中的研究报道相较其他肿瘤显得十分稀少，目前的研究多集中于胰腺NETs(pancreatic NETs,pNETs)及小肠NETs。Roldo等[26]对正常胰腺组织、胰岛组织、pNETs组织及胰腺腺泡细胞肿瘤组织进行miRNA表达谱分析，结果显示胰腺肿瘤组织较非肿瘤组织miRNA103/107明显上调，同时伴miRNA-155缺失或下调；pNETs同腺泡细胞癌相比，包括miR-125a/99a/99b/125b-1/342/130a/132/129-2/125b-2在内的10个miRNA显著差异表达。他们认为,上述差异有助于鉴别肿瘤与非肿瘤以及pNETs与胰腺腺泡上皮来源的肿瘤。另外，miR-204在胰岛素瘤中特异性高表达，且与胰岛素的表达密切相关；miR-21与Ki67指数及肝转移高度相关[26]。Ruebel等[27]研究发现,miR-133a在小肠NETs从原发到转移的进程中，出现相应的表达下调，表明其在疾病进展过程中有重要作用。Li等[28]针对小肠NETs中miRNA表达情况的研究显示，在小肠NETs进展过程中miR-96/182/183/196/200出现显著上调。上述这些miRNA被认为是pNETs或小肠NETs潜在的分类和预后判断标志物，对它们进行深入研究，阐明其作用机制和表达变化情况，并制订可行的临床检测策略，将明显提高pNETs或小肠NETs的检出率，以及预后判断的准确性。一项针对结肠腺癌与正常结肠黏膜miRNA 差异表达的研究中，涉及1例结肠NETs样本，发现包括miR-96在内的38个miRNA在结肠NETs中较正常黏膜显著上调，且其中仅有6个miRNA在腺癌中出现上调，这提示miRNA的表达检测可能有助于鉴别结肠NET与腺癌。该研究中上调的部分miRNA(miR-96/182/196a/488)在Li等[29]的研究中也出现了上调[28]，这些miRNA有望成为GEP-NETs深入研究的对象。但需要注意的是，该研究仅涉及1例结肠NET样本，大样本量的后续研究十分必要。

4miRNA与临床实践

4.1miRNA辅助诊断研究表明，新鲜组织、石蜡样本、血浆和血清乃至尿液和唾液均可用于检测miRNA表达情况，这使其具有很好的临床实用性[13]。miRNA仅有21～22个核苷酸，相比DNA或mRNA而言，其在体内外均具有明显的长期稳定性，这使运用miRNA分析技术对临床样本进行检测具有很好的敏感性和稳定性，即使在石蜡样本中，miRNA分析依然具有相当高的敏感性。Nuovo等[30]研究发现，在石蜡样本上进行原位杂交检测，可在细胞或者亚细胞水平显示miRNA的表达情况，这使miRNA检测有望成为临床病理学诊断的辅助工具。

miRNA的一项重要特点是具有类似于内分泌激素的特性，它与核仁磷酸蛋白1等RNA结合蛋白一起，经包装与转运，以外分泌小体或者突触小泡的形式被运出细胞，成为循环miRNA，经血液循环及受体细胞内吞作用，与胞内蛋白结合，从而作用于周边细胞或机体远隔部位[8,31-33]。循环miRNA具有很高的稳定性和抗性，易于收集和储存，使其作为生物标志物服务于临床检测成为可能[25]。检测血浆或血清中的特异性miRNA表达情况有助于肿瘤的诊断；部分循环miRNA的表达水平同某些肿瘤的抗药性相关联，监测这些miRNA有助于判断患者对抗肿瘤药物的敏感性和耐药情况[19,25]。Matthaei等[34]将胰腺肿瘤囊内液作为分析样本，研究miRNA的表达谱，他们指出9个miRNA( miR-24/30a-3p/18a/92a/342-3p/99b/106b/142-3p/532-3p)的特征性差异表达可用以鉴别pNETs与胰腺的其他肿瘤(如导管内乳头状黏液性肿瘤等)。Li等[35]分析慢性胰腺炎患者、胰腺腺癌患者、pNETs患者和健康人群的血清循环miRNA表达谱，指出miR-1290的下调对于鉴别pNETs和腺癌极具参考价值。

4.2miRNA辅助治疗miRNA在肿瘤中的差异表达及其在转录后水平调节靶基因表达所表现的抑癌或促癌功能，使其成为肿瘤治疗的潜在生物靶点[36]。目前基于miRNA的治疗策略大体分为两类：通过转染或直接导入人工合成的miRNA，使有抑癌基因特性的miRNA表达上调，从而抑制肿瘤的生长；应用与特异miRNA互补的反义小分子核苷酸与相应的miRNA结合，来沉默或竞争与mRNA的结合，使有癌基因特性的miRNA功能得以阻断，从而抑制肿瘤的生长[37-38]。Kota等[39]通过腺病毒感染给肝癌模型小鼠全身给予miR-26a后发现肿瘤体积明显减小。Lanford等[40]研究证实，在小鼠或者灵长类动物中通过全身给予反miR-122的寡聚核苷酸可以改变肝脏脂类代谢以及减少乙型肝炎病毒的复制，从而减轻肝脏损伤，且无明显不良反应。随后，他们开展了首例基于miRNA治疗策略的临床试验(miravirsen or SPC3649)。

5小结

目前，早期诊断及手术切除是GEP-NETs的最佳诊治策略。因此，针对miRNA作为GEP-NETs诊断标志物和治疗靶点的研究极具临床前景。当前，GEP-NETs相关miRNA的基础及临床研究仍不足，主要面临的问题有：GEP-NETs起源及演进机制有待研究阐明；miRNA作用机制尚未完全阐明，miRNA与靶基因之间多对多的关系，使得完整揭示其调控网络较困难；如何安全有效地使用miRNA类似物或其反义核苷酸治疗肿瘤仍需进一步研究。相信，随着这些问题的逐步解开，miRNA必将为GEP-NETs的研究及诊治注入新的活力。

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Research Progress and Clinical Application of miRNAs in Gastroenteropancreatic Neuroendocrine TumorsYANGYi,WANGZhi-gang.(DepartmentofGeneralSurgery,ShanghaiJiaotongUniversityAffiliatedSixthPeople′sHospital，Shanghai200233,China)

Abstract:MicroRNAs(miRNAs) are a family of 21-22 nucleotides,non-coding small RNAs that function as posttranscriptional gene regulators.They are involved in critical biologic processes including proliferation,differentiation and apoptosis.A myriad of studies have demonstrated that miRNAs can act as tumor-suppressors or oncogenes in the origin and progress of human neoplasms.Aberrant miRNA expression can be a sensitive hallmark and therapeutic target.It is reported that aberrant miRNA expression is also occurred in the development and progress of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors,which is of potential clinical value.

Key words:MicroRNA; Neuroendocrine tumor; Gastrointestinal tract; Pancreas

收稿日期：2015-01-19修回日期：2015-03-30编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.015

中图分类号：R656; R735

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)21-3883-04