DNA损伤修复机制和糖尿病造成的动脉粥样硬化

曾　理(综述)，丁群芳(审校)

(1.四川省医学科学院 四川省人民医院老年科，成都 610041； 2.四川大学华西医院老年科，成都 610041)



DNA损伤修复机制和糖尿病造成的动脉粥样硬化

曾理1△(综述)，丁群芳2※(审校)

(1.四川省医学科学院 四川省人民医院老年科，成都 610041； 2.四川大学华西医院老年科，成都 610041)

摘要：动脉粥样硬化及其所引起的心肌梗死、脑卒中、冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)等是导致老年人病死率增加的重要原因。DNA损伤是激活DNA损伤修复路径导致细胞早衰的重要原因，而动脉粥样硬化中存在DNA损伤及DNA损伤修复机制参与的证据。糖尿病作为心血管疾病危险因素具有导致DNA损伤，从而加速血管老化的作用。该文综述了动脉粥样硬化疾病中DNA损伤和DNA双链损伤修复机制的研究进展，从而为防治动脉粥样硬化疾病提供新的思路。

关键词：糖尿病；动脉粥样硬化；DNA损伤修复机制；细胞衰老

糖尿病是影响公众健康的重大疾病，是以血糖升高并伴随碳水化合物、脂肪和蛋白质等物质代谢紊乱的疾病[1]。在罹患糖尿病的随后几年至几十年间会出现多种并发症[2]。目前全球大约有1亿糖尿病患者，预计到2025年糖尿病患者将是现在的2倍[3-4]。许多研究证实，心血管疾病与糖尿病存在极强的联系，糖尿病导致过量的非酯化脂肪酸、氧化应激、炎症反应、胰岛素抵抗及内皮源性一氧化碳减少，从而显著增加动脉粥样硬化的发生风险，导致心血管疾病的发生[5-6]。另一方面，动脉粥样硬化斑块中存在细胞衰老的证据，心血管疾病的危险因素也可能加速细胞衰老[7]。而DNA双链损伤修复机制是细胞衰老的重要机制之一，现就DNA双链损伤修复机制在糖尿病及血管损害中的作用进行综述。

1细胞衰老的机制

细胞衰老是一种最基本的细胞行为，主要表现为细胞周期的永久性停滞及一系列特殊的细胞形态、功能和基因表型的变化[8]。Hayflick和Moorhead[9]最早于1961年提出复制性衰老的机制，该机制是依赖于端粒的缩短而产生的。细胞每发生一次分裂，端粒则缩短一段，当端粒缩短达到一定的片段时无法再缩短，将促发细胞停止分裂增殖，发生复制性衰老[10]。除了依赖端粒的细胞衰老机制外，研究发现，人成纤维细胞在低剂量的过氧化氢刺激下，细胞没有出现端粒长度的缩短，但细胞老化β-半乳糖苷酶染色阳性比例增加[11]。与人成纤维细胞相比，虽然鼠胚胎成纤维细胞具有端粒更长、端粒酶活性更高的特性，但在20%高压氧体外培养下，DNA损伤累积增加，细胞仅分裂数代即出现细胞周期停滞，而改为标准条件培养后该现象消失[12]。可见，与复制性衰老相比，这种细胞衰老并不是由于端粒缩短造成的，而是由于发生了DNA损伤所导致的[12-13]。这种由电离辐射、化疗药物、内源性活性氧及外源性应激引起的DNA损伤所导致的细胞衰老称为应激性早衰[13]。

2糖尿病与氧化应激

氧化应激被认为是血管内皮损伤的重要机制，高糖导致大量的氧自由基产生，而氧自由基又产生过氧硝酸盐，这种强氧化剂穿过细胞膜使蛋白底物亚硝基化，从而降低抗氧化酶的活性；当氧自由基积累超过了抗氧化系统的清除能力时，氧化应激会削弱或者降解一氧化氮的生物学活性，而一氧化氮生物活性减弱是导致心血管疾病发生的重要原因[14]。研究发现，在5.5 mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L和33 mmol/L等不同糖浓度条件下培养人脐静脉内皮细胞72 h，与正常糖浓度(5.5 mmol/L)相比较，高糖组细胞老化、β-半乳糖苷酶染色阳性率明显增加，伴有活性氧水平增加及一氧化氮水平降低，且随糖浓度上升有明显变化[15]。可见，高糖可能通过氧化应激和降低保护性因子一氧化氮，导致血管内皮细胞发生应激性早衰，从而导致血管内皮细胞功能失调。

3DNA损伤修复机制

在正常细胞中，由于电离辐射、化疗药物、活性氧等原因发生DNA损伤后，都有相对应的一系列复杂的机制纠正这种损伤，保持基因组的完整性，这些机制即为DNA损伤修复机制。DNA损伤修复路径是一个错综复杂的信号转导系统，其中毛细血管共济失调突变基因(ataxia telangiectasia mutated,ATM)/细胞周期检测点激酶(checkpoint kinase，CHK)2和Rad3相关蛋白(Rad3-related protein,ATR)/CHK1是两条主要通路[16]。一旦DNA损伤发生，将激活ATM和ATR对损伤发生反应。ATM主要感知DNA双链损伤，ATR主要感知DNA单链损伤，某些情况下，ATR的激活也需要ATM的参与，因此ATM是DNA双链损伤修复路径中的主要感应器[17]。当DNA双链损伤发生时，ATM立即诱导组蛋白2A变异体(histone family 2A variant,H2AX)发生S139位点的磷酸化形成γ-H2AX[15],γ-H2AX在DNA双链损伤过程中具有标志性的意义。当细胞发生DNA双链损伤时，H2AX发生磷酸化并形成γ-H2AX焦点，所形成的γ-H2AX焦点和DNA双链损伤在数量上基本呈1∶1的关系[18]。ATM/ATR继续激活下游的检测蛋白CHK1和CHK2，这两种蛋白激酶将DNA损伤修复机制与细胞周期联系在一起，它们通过多种机制使部分细胞周期蛋白依赖性激酶减少，以便控制细胞周期，但有些细胞周期蛋白需要下游的p53调控，因此CHK2发生磷酸化后，继续诱导下游p53蛋白发生磷酸化，使磷酸化p53蛋白表达增高[19]。p53蛋白是一种肿瘤抑制因子，当DNA损伤时，体内p53水平激增，促使一系列反应发生，使细胞周期在进入S期前发生停滞，并激活一系列修复分子，进行DNA修复，防止错误信息继续传递；当损伤无法修复时，则会导致细胞衰老或凋亡及肿瘤发生。

除了传统信号通路参与DNA损伤修复反应外，其他遗传物质也参与了该反应的调解。微RNA(microRNA，miRNA)是近几年在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码RNA，主要参与基因转录后水平的调控。miRNA基因的转录初产物很快被核糖核酸酶Ⅲ家族酶Drosha加工成为miRNA前体，然后由细胞核转运至细胞质中，经Dicer酶识别剪切为成熟miRNA。研究发现，Dicer和Drosha对于激活DNA损伤反应是必需的，而不是RNA干扰信号通路中的下游元件[20]。还发现，miRNA可对DNA损伤修复基因进行调控，miR-421通过直接与ATM的3′非编码区信使RNA结合调节ATM的表达，改变细胞周期S期检测点，同时增加细胞放射敏感性[21]。H2AX是miR-24调节的对象，miR-24过度表达可下调H2AX表达，使细胞对射线的敏感性增加[22]。miR-504和miR-125b通过与p53转录产物的3′非编码区结合，抑制p53的表达，使细胞对DNA损伤修复能力减弱[23-24]。

4DNA损伤修复机制与糖尿病所致动脉粥样硬化

4.1糖尿病中DNA损伤及DNA损伤修复机制参与的证据Leinonen等[25]对81例病程>9年的非胰岛素依赖型糖尿病患者24 h尿液进行分析发现，非胰岛素依赖型糖尿病组的患者尿液中8-氧鸟嘌呤脱氧核苷(7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine，8-oxo-dG)的量与正常对照组相比显著增加(P=0.001)，且尿液中8-oxo-dG的水平与糖化血红蛋白水平呈正相关。在不同糖浓度(5.5 mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L和33 mmol/L)条件下培养人脐静脉内皮细胞72 h后，发现随着血糖浓度的增加，老化β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例增加，且γ-H2AX和磷酸化p53表达增加[15]。自发性糖尿病大鼠血中p53表达显著升高，给予大鼠运动干预后，大鼠血糖显著下降，同时伴有p53表达显著下降[26]。分析12例胰岛素依赖型糖尿病和15例非胰岛素依赖型糖尿病患者外周血白细胞中8-oxo-dG的水平，发现与正常对照组相比，胰岛素依赖型糖尿病和非胰岛素依赖型糖尿病组白细胞中8-oxo-dG的水平均显著增加；同时，采用鲁米诺化学发光检测胰岛素依赖型糖尿病和非胰岛素依赖型糖尿病组活性氧水平，发现两组平均活性氧水平与其相匹配的正常对照组相比显著增加(P<0.01)[27]，表明糖尿病或高血糖可能通过氧化应激导致DNA损伤增加。

4.2动脉粥样硬化中DNA损伤及DNA损伤修复机制参与的证据Martinet等[28]对13例颈动脉狭窄>70%的患者颈动脉粥样硬化斑块进行研究发现，与人正常乳内动脉相比，颈动脉粥样硬化斑块内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞中 8-oxo-dG 免疫组织化学染色表达呈强阳性(染色面积>90%)；从颈动脉粥样硬化斑块和人乳内动脉标本中提取出染色体DNA进行分析，发现斑块中8-oxo-dG的水平(160±29) 8-oxo-dG /105dG是对照组(3±1) 8-oxo-dG /105dG的55倍；同时，通过彗星实验检测DNA断裂损伤，与正常乳内动脉相比，颈动脉粥样硬化斑块中彗星尾部长度及尾矩均显著增加，说明DNA断裂损伤增加。Mahmoudi等[29]根据美国心脏学会疾病分级方法将50例颈动脉粥样硬化患者按疾病程度分为Ⅰ～Ⅳ级，其颈动脉粥样硬化斑块免疫组织化学磷酸化ATM和γ-H2AX染色表达呈阳性，且随着疾病严重程度增加磷酸化ATM和γ-H2AX呈阳性表达增加；与正常人血管平滑肌细胞相比，斑块中分离出的血管平滑肌细胞免疫荧光染色显示磷酸化ATM和γ-H2AX表达增加；彗星实验发现DNA损伤增加。p53处于DNA损伤修复通路的下游，决定着细胞的最终结局，即衰老、凋亡或肿瘤发生。Miah等[30]对颈动脉粥样硬化斑块分析发现，与正常对照组相比，斑块中p53表达呈阳性。与无动脉粥样硬化的血管相比，人颈动脉粥样硬化的标本中与DNA损伤修复相关蛋白p53、磷酸化p53表达均增加[31]。Yuan等[32]对62例患者的颈动脉粥样硬化斑块进行分析，将斑块类型分为无坏死核心、有坏死核心及斑块破裂组，免疫组织化学显示，3组均有p53表达，且有坏死核心及斑块破裂组p53表达较无坏死核心组明显；根据临床症状分类分析，有短暂性脑缺血发作的患者斑块中p53表达较无症状组显著升高。有研究发现，356例有心血管疾病危险因素但无心血管疾病者的血浆中p53水平与其颈动脉的厚度存在正相关(r=0.594,P<0.01)[33]。可见，DNA损伤修复机制相关信号蛋白参与颈动脉粥样硬化的发生、发展，并与颈动脉粥样硬化病变严重程度相关。

4.3DNA损伤修复机制与动脉粥样硬化的危险因素以高胆固醇饮食饲养雄性新西兰大白兔24周后，血脂水平升高[总胆固醇(19.0±2.2) mmol/L、低密度脂蛋白胆固醇(15.3±2.5) mmol/L、三酰甘油(5.7±1.4) mmol/L]，同时伴有动脉粥样硬化斑块内膜8-oxo-dG的表达强烈；改低脂饲养，分别于4周、12周、24周观察，血脂水平显著下降，低脂饲养24周后，高脂血症可完全逆转[总胆固醇(1.3±0.03) mmol/L、低密度脂蛋白胆固醇(1.7±0.2) mmol/L、三酰甘油(1.7±0.3) mmol/L]；同时，随着低脂饲养时间的延长，兔胸主动脉内膜8-oxo-dG的表达减少[28]。在一项临床多中心随机对照试验中，纳入110例患有代谢综合征的女性，年龄55～80岁，长期教育并执行低脂饮食或地中海饮食方式1年，该组人群尿中8-oxo-dG水平与对照组相比显著降低(P<0.001)[34]。Kliemann等[35]对600例6～18岁青少年进行的研究发现，体质指数、体脂水平、总胆固醇水平、低密度脂蛋白水平与彗星实验中DNA损伤百分比呈线性正相关；每日摄入维生素C饮食后，DNA损伤减少，且每日维生素C摄入量与DNA损伤百分比呈线性负相关。高脂血症可加剧DNA损伤，改善血脂及抗氧化治疗可降低DNA损伤水平。

5小结

细胞衰老的机制可能参与动脉粥样硬化的发生。DNA损伤加剧及DNA损伤修复机制的激活可能参与了细胞衰老及动脉粥样硬化的过程。糖尿病、肥胖、高脂血症等作为动脉粥样硬化的危险因素，可能通过增加氧化应激水平加速DNA损伤及DNA损伤修复机制的激活，从而引起细胞应激性早衰及动脉粥样硬化发生。对于DNA损伤及DNA损伤修复路径的研究也可能为防治动脉粥样硬化提供新的靶点。

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Advances in the Relationship between DNA Damage Repair Mechanism and Diabetic AtherosclerosisZENGLi1,DINGQun-fang2.(1.DepartmentofGeriatrics,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople′sHospital，Chengdu610041，China; 2.DepartmentofGeriatrics,WestChinaHospital,SichuanUiversity，Chengdu610041，China)

Abstract:Atherosclerosis and the subsequent cardiovascular complications such as myocardial infarction,stroke,and coronary atherosclerotic heart disease are major causes of death among the elderly.DNA damage is the cause of the activation of the DNA damage repair pathway resulting in cell senescence,and the evidence that DNA damage and DNA damage repair mechanism participate in the process of atherosclerosis has been found in some studies.Diabetes,as a risk factor of cardiovascular disease,can lead to DNA damage,so as to accelerate the aging of blood vessels.Here is to make a review of the research development of DNA damage and DNA double strand damage repair mechanism,to provide a new method to prevent and treat atherosclerosis.

Key words:Diabetes; Atherosclerosis; DNA damage repair mechanism; Cellular senescence

收稿日期：2014-11-18修回日期：2015-03-31编辑：郑雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.036

中图分类号：R587.1

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)19-3553-04