双级靶向纳米载体在脑肿瘤诊断和治疗方面的应用

·综述·

双级靶向纳米载体在脑肿瘤诊断和治疗方面的应用

高洪元1a，吴建勇1b，倪曙民2(1.复旦大学附属华山医院静安分院，a.肿瘤科;b.临床药理科，上海 200040；2.宁波大学附属医院肿瘤科，浙江 宁波 315020)

[摘要]血脑屏障的存在严重阻碍了脑肿瘤化疗药物向脑内递送。纳米粒、脂质体、胶束等纳米载体可显著增加药物的穿过血脑屏障转运的能力，采用单一或双功能基制备的双级靶向纳米载体还可进一步增加药物的脑内递送及在脑肿瘤病变部位的浓集，从而显著提高脑肿瘤的诊断和治疗效果。笔者主要介绍双级靶向纳米载体的设计思路、靶向功能基的最新研究进展，为相关研究提供参考。

[关键词]双级靶向；纳米载体；脑肿瘤；诊断；治疗

[作者简介]高洪元，本科，主治医师.研究方向：肿瘤治疗.Tel：13916249373；E-mail：gaogaogen@163.com

[中图分类号]R979.1[文献标志码]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.01.003

[收稿日期]2013-11-12[修回日期]2014-04-21

Application of dual-targeting nano-carriers in diagnosis and therapy of brain tumors

GAO Hongyuan1a,WU Jianyong1b,NI Shumin2(1.Huashan Hospital Affiliated to Fudan University Jing′an Branch,a.Department of Oncology;b.Department of Clinical Pharmacology,Shanghai 200041,China;2.Department of Oncology,Affiliated Hospital of Ningbo University,Ningbo 315020,China)

Abstract[]The delivery of therapeutical agents for brain tumors′ treatment is enormously prevented by the presence of blood-brain barrier.Nano-carriers such as nano-particles，liposomes and micelles can significantly increase the transport of drugs across the blood-brain barrier.The dual-targeting nano-carriers modified by one or two functional groups can further increase the brain delivery of drugs as well as their accumulation in brain tumors，resulting in significant improvement in the diagnosis and therapy of brain tumors.This article mainly focused on the recent development of strategies and functional groups of dual-targeting nano-carriers，providing a reference for relevant investigations.

[Key words]dual-targeting;nano-carrier;brain tumor;diagnosis;therapy

脑肿瘤的诊断和治疗是目前医学领域的一项巨大挑战，其主要原因是血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的存在严重阻碍了药物的脑内递送，绝大部分经血管给予的诊断试剂或治疗药物难以在脑组织中达到目标浓度[1]。具有脑靶向特性的纳米载药系统可以增加药物的脑内递送，这些系统的主要特点是纳米载体，如脂质体、纳米粒、胶束等与可特异性结合于BBB的功能基结合在一起，以受体介导、吸附介导、转运体介导等方式促进纳米载体穿过BBB进入脑组织，比如转铁蛋白(Tf)、乳铁蛋白(Lf)等的修饰可显著增加脂质体的脑内转运，增强药物的治疗效果[2，3]。但是，纳米载体在通过BBB后广泛分布于整个脑内，减弱了药物在病变部位的治疗作用，同时增加了药物、尤其是抗肿瘤药物对正常脑组织的损伤，有可能引起严重的毒副作用。理想的给药方式是药物跨过BBB后还能更多地浓集于病变区，如脑肿瘤部位，因此，近年来“双级靶向”的概念逐渐兴起并受到重视，其主要思路是首先利用靶向于BBB的功能基将药物递送入脑，然后利用靶向于病变部位的功能基使药物浓集于目标区域，从而在提高药物疗效的同时降低其毒副作用。笔者就双级靶向纳米药物载体在脑肿瘤诊断和治疗方面的应用现状做一介绍，为其进一步研究提供参考。

1单一功能基介导的双级靶向纳米载体

某些功能基既可以特异性结合于BBB，也能高效结合于肿瘤组织或细胞，因此，仅以一种功能基修饰纳米载体就可实现双级靶向的目的，具有这种性质的靶向功能基主要有angiopep-2、胆碱衍生物、peptide 22肽、MT1-AF7p肽等，下面分别对其进行介绍。

1.1　angiopep-2

angiopep-2 (TFFYGGSRGK-RNNFKTEEY)是目前研究最多的双级靶向功能基，它是Kunitz型结构域的衍生肽，可特异性结合于在BBB及胶质瘤细胞均过表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)，其胞吞转运能力及脑实质内的蓄积作用显著高于Tf、Lf及抗生物素蛋白，而且它不是外排泵P-糖蛋白的底物，这有利于减少药物载体在脑内皮细胞上的外排[4]。

Xin等[5，6]设计了angiopep-2共价结合的聚乙二醇-聚己内酯纳米粒(ANG-NP)，用于脑胶质瘤的治疗。与未修饰的纳米粒(NP)相比，ANG-NP在人恶性胶质瘤U87 MG细胞上的内吞作用显著增加。抗增殖和细胞凋亡实验表明，载紫杉醇的ANG-NP具有明显的抑制U87 MG细胞的作用。以BBB单层膜模型，如脑毛细血管内皮细胞(brain capillary endothelial cells，BCECs)考察纳米粒的体外跨BBB特性，结果显示，angiopep-2修饰后纳米粒的转运率显著增加，而且单层膜下层的U87 MG细胞的活性明显降低。ANG-NP在体外3D肿瘤球和体内胶质瘤上的渗透、分布和蓄积均明显高于NP。与泰素和NP相比，载紫杉醇的ANG-NP的抗胶质瘤作用显著增强。初步安全性实验表明，连续7 d静脉给予小鼠空白ANG-NP 100 mg/(kg·d)，未见血液系统、肝、肾及脑组织产生急性毒性。同时，Xin等[7]还以异硫氰酸若丹明B为荧光探针考察了ANG-NP的脑靶向转运机制：ANG-NP主要是通过穴样凹陷介导和网格蛋白介导的胞吞作用进入BCECs，其细胞摄取呈时间、浓度及能量依赖性；angiopep-2修饰后纳米粒在皮质层、侧脑室、第三脑室及海马处的蓄积量明显增加；采用游离的低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的配体(如angiopep-2或载脂蛋白)作为特异性受体抑制剂可显著抑制ANG-NP的BCECs摄取、体外BBB模型转运的穿透性及体内脑组织的渗透性，说明ANG-NP的脑靶向作用可能是通过LRP受体介导的。

Huang等[8]将angiopep-2以双功能基PEG连接在高分子聚合物PAMAM上，然后与DNA复合，形成PAMAM-PEG-angiopep/DNA纳米粒。细胞摄取机制表明，该纳米粒可通过内涵体/溶酶体通路进入细胞核。与未经angiopep-2修饰的纳米粒及未PEG化的纳米粒相比，靶向纳米粒在脑组织尤其在肿瘤部位的分布明显增加。与其他各组及市售替莫唑胺相比，靶向纳米粒可诱导更广泛的肿瘤细胞凋亡。在体内抑制脑肿瘤实验中，靶向纳米粒与替莫唑胺组的荷瘤小鼠的中位生存期分别为61 d和49 d，显著高于其他各组。

Ren等[9]制备了angipep-2修饰的PEG化的氧化多壁碳纳米管的双级靶向递药系统(O-MWNTs-PEG -ANG)，用于增强阿霉素对脑胶质瘤的治疗效果。体外细胞实验表明，angipep-2的修饰可显著增加BCECs及脑胶质瘤C6细胞对碳纳米管的摄取，且大部分碳纳米管进入细胞溶酶体内。体内荧光成像实验证实，O-MWNTs-PEG-ANG不仅可较多地进入脑组织内，更能蓄积于脑肿瘤部位。载阿霉素的O-MWNTs-PEG-ANG的C6细胞毒性高于阿霉素、对荷胶质瘤小鼠的中位生存期的延长作用也优于阿霉素。另外，以BCECs和C6细胞毒性、血液学分析及CD68免疫组化分析评价O-MWNTs-PEG-ANG的生物安全性，结果显示其毒性低、生物相容性良好。以组织病理学分析评价载阿霉素O-MWNTs-PEG-ANG的生物安全性，结果显示其心脏毒性低于阿霉素。这些结果显示O-MWNTs-PEG-ANG是一种理想的双级靶向递药系统，有助于提高脑胶质瘤的治疗效果，但碳纳米管本身的毒性仍然存在争议，较大剂量入脑的安全性可能需要进一步实验的证实。

1.2　胆碱衍生物

胆碱衍生物首先由Li等[10]设计合成，并证实其脑靶向特性。脑毛细血管内皮细胞上分布着大量的特异性转运体，用于脑组织的营养供给，这些转运体可高效转运特定的营养物质进入脑内。胆碱转运体就是其中的典型代表，它在BBB上广泛分布，并可转运大量胆碱穿过BBB，因而可作为脑靶向递药的靶点。同时，脑胶质瘤的恶性程度高，需要摄入大量的胆碱来合成膜磷脂，因而在胶质瘤细胞上，包括胆碱转运体样蛋白(CTL1)在内的胆碱转运体是过表达的[11]。因此，可与胆碱转运体高效结合的胆碱衍生物是脑肿瘤潜在的双级靶向功能基。

Li等[12]将阿霉素插入到Trail质粒中形成稳定的复合物，并以树状聚左旋赖氨酸(DGL)压缩该复合物形成纳米共给药系统，然后以胆碱衍生物修饰该共给药系统。U87 MG细胞摄取实验中，胆碱衍生物的修饰显著增加了共给药系统的摄取率和细胞杀伤作用。与单用一种药物及未修饰的系统相比，胆碱衍生物的修饰增加了共给药体系诱导的体内外细胞凋亡。荧光成像结果显示，胆碱衍生物的修饰明显增加了共给药系统在小鼠脑肿瘤部位的蓄积，同时减少了其在肝、脾的分布。体内抑制U87 MG移植瘤实验中，胆碱衍生物修饰的共给药系统组的荷瘤小鼠的中位生存期(47 d)显著优于未修饰的共给药系统组(37 d)和游离阿霉素组(32 d)，证实了该靶向共给药系统的优势。另外，以胆碱衍生物修饰的DGL包封钆造影剂也可明显增强其对脑胶质瘤的磁共振(MRI)诊断效果[13]。

1.3　peptide 22肽

peptide 22肽(Ac-[cMPRLRGC]c-NH2)是经噬菌体展示技术筛选出的多肽，对BBB和脑胶质瘤过表达的低密度脂蛋白受体(LDLR)具有高亲和力，而且它不会与内源性的低密度脂蛋白发生竞争性抑制，有利于纳米载体的有效递送[14]。Zhang等[15]采用ELISA实验验证了LDLR在大鼠胶质瘤C6细胞及BCECs上高表达，并证实其在大鼠心肌H9c2(2-1)细胞上低表达。细胞摄取实验表明，peptide-22肽的修饰显著增加了C6细胞、BCECs对PEG-PLA纳米粒的摄取，但是H9c2(2-1) 细胞的摄取量未增加，同时，游离的peptide-22肽可显著抑制C6细胞、BCECs对修饰后纳米粒的摄取。细胞摄取机制实验表明，C6细胞、BCECs对纳米粒的摄取具有能量依赖性，并通过穴样凹陷介导及网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。在体外BBB模型上，peptide-22肽的修饰显著增加了纳米粒穿过BBB转运的能力以及BBB下层C6细胞的凋亡，而且这些作用可被游离的peptide-22所抑制。体外及体内荧光成像显示，peptide-22肽修饰的纳米粒可穿过BBB并显著增加纳米粒在脑胶质瘤部位的蓄积。同时，peptide-22肽修饰的纳米粒可明显增加体内肿瘤细胞凋亡，并显著延长荷脑胶质瘤小鼠的中位生存期。这些结果表明，peptide-22肽是一种高效的双级靶向功能基，可介导纳米载体向脑胶质瘤的转运。

1.4　MT1-AF7p肽

虽然在胶质瘤发生的同时一般会伴随着BBB通透性的增加，但是血-肿瘤屏障(brain-tumor barrier，BTB)仍然存在，其低通透性是限制抗肿瘤药物递送的主要障碍；同时，到达肿瘤部位的药物难以向胶质瘤内部渗透也是治疗效果较差的原因之一。

膜型基质金属蛋白酶1 (MT1-MMP)表达于多数的新生血管和胶质瘤细胞，与胶质瘤的发生密切相关，是胶质瘤靶向治疗的潜在靶点。经噬菌体展示技术筛选获得的MT1-AF7p肽(HWKHLHNTKTFL)就是对MT1-MMP具有高亲和性的多肽[16]。Gu等[17]制备了MT1-AF7p肽修饰的PEG-PLA纳米粒(MT1-NP)，并考察其体内外靶向性效果。C6胶质瘤细胞摄取实验显示，MT1-NP的细胞内蓄积量显著高于未修饰纳米粒，主要摄取方式是能量依赖性的巨胞饮和脂筏介导的内吞。体内荧光成像及胶质瘤分布实验表明，MT1-AF7p肽的修饰显著增加了纳米粒穿过BTB转运的能力及在胶质瘤实质内的蓄积。体外C6肿瘤球实验表明，MT1-NP可高效地进入肿瘤球内并显著增加紫杉醇对肿瘤球的抑制作用。体内抑制C6胶质瘤实验中，与未修饰的纳米粒相比，MT1-NP显著延长了荷瘤小鼠的中位生存期(48 d与32 d之比)，证实了MT1-AF7p的靶向效果。

这些具有双级靶向特性的功能基多为人工合成的多肽类化合物，结构简单，性质较为稳定，适合工业化生产，尤其是被广泛证实靶向效果的angiopep-2，有望在近年应用于临床研究中。

2双功能基介导的双级靶向纳米载体

由于某些特异性受体仅高表达于BBB或脑肿瘤细胞，或者功能基在经过第一级屏障时不能继续发挥作用，这就需要多个功能基的配合使用以提高靶向效率，如靶向于BBB的Tf、TGN肽等与靶向于脑肿瘤的叶酸、RGD肽等配合使用。

2.1　TGN肽与AS1411适体的配合使用

TGN肽(TGNYKALHPHNG)是经噬菌体展示技术获得的、可特异性结合于BBB的多肽，以其修饰纳米粒后可显著增加纳米粒的脑内递送[18]。AS1411适体是一种富含鸟嘌呤的寡核苷酸，可结合于在C6胶质瘤细胞浆膜高表达的核仁蛋白，从而增强与其相连的纳米粒的抗肿瘤作用[19]。

Gao等[20]采用TGN肽和AS1411适体修饰PEG-PCL纳米粒，构建了脑胶质瘤级联递药系统。体外细胞摄取和3D肿瘤球渗透实验证实，该系统不仅可以结合于bEnd.3内皮细胞和C6肿瘤细胞，还可以穿透内皮细胞单层和肿瘤细胞到达肿瘤球的内部，这在胶质瘤治疗中极为重要。体内荧光成像实验进一步证实，双级靶向纳米粒的脑内分布特性(胶质瘤内荧光强度、胶质瘤/正常脑组织荧光强度比)显著优于单修饰及未修饰的纳米粒。体内抑瘤实验中，载多西紫杉醇的双级靶向纳米粒显示了最好的抗胶质瘤作用，明显延长了荷胶质瘤小鼠的中位生存期。

2.2　Tf与叶酸的配合使用

Tf可与BBB上高表达的Ⅱ型跨膜糖蛋白-转铁蛋白受体(TfR)特异性结合，以受体介导的方式穿过BBB，也是目前研究最多的BBB靶向功能基。叶酸受体在许多肿瘤细胞中过表达，并随着肿瘤恶性程度的提高而增多，因而可作为肿瘤靶向功能基。Gao等[21]将Tf和叶酸修饰在脂质体上，制备了载多柔比星的双级靶向脂质体。在体外bEnd.3 BBB模型中，双级靶向脂质体组的细胞中药物蓄积、P糖蛋白表达及药物穿过BBB转运的能力均显著优于未修饰及单修饰的脂质体。体内分布实验表明，双级靶向脂质体可透过BBB，并主要分布于脑肿瘤部位。体内抑瘤实验中，双级靶向脂质体可减小肿瘤的体积并延长荷C6脑胶质瘤大鼠的生存期。双级靶向脂质体增加了脑肿瘤的治疗效率，并减小了多柔比星的毒性，显示了良好的脑靶向作用。

2.3　Tf与RGD肽的配合使用

RGD肽是经噬菌体展示技术筛选得到的三肽，可特异性结合于肿瘤细胞过表达的整合素受体，将其制成五元环化结构[如c(RGDfK)、c(RGDfC)、c(RGDyK)、c(RGDyC)等]时其稳定性和结合特性还会有所提高[22]。Zhang等[23]构建了Tf修饰的包载c(RGDfK)-紫杉醇结合物的胶束(TRPM)，并评价了其靶向效率、抗胶质瘤活性及体内外毒性。与未修饰胶束相比，Tf的修饰使BCECs对胶束的摄取增加了2.4倍，提高了静脉注射后药物在脑内的蓄积。随后，c(RGDfK)-紫杉醇结合物从胶束中释放出来，并靶向结合于整合素过表达的胶质瘤细胞，从而显著延长了其在胶质瘤及肿瘤旁组织的滞留。更重要的是，TRPM具有更强的体内抗胶质瘤活性，该组荷颅内U87 MG胶质瘤小鼠的中位生存期(42.8 d)显著长于Tf修饰的紫杉醇胶束组(39.5 d)、未修饰的紫杉醇胶束组(34.8 d)、泰素组(33.6 d)及生理盐水组(34.5 d)。另外，TRPM没有引起小鼠体重的下降，而且其毒性低于Tf修饰的紫杉醇胶束。

2.4　Tf与他莫昔芬的配合使用

他莫昔芬是一种选择性雌激素受体调节剂，可逆转多药耐药蛋白对药物的外排，有可能会抑制BBB和肿瘤细胞上表达的药物外排转运体，从而增加药物穿过BBB的转运能力及肿瘤细胞的摄取能力[24]。Tian等[25]以他莫昔芬和Tf修饰了包载表柔比星的脂质体，并以C6胶质瘤细胞、C6肿瘤球、体外BBB模型及荷C6脑胶质瘤大鼠来评价该脂质体的体内外特性。体外实验中，双修饰脂质体显示出最强的抑制C6胶质瘤细胞或肿瘤球的作用，还可显著增强穿过BBB的转运能力及靶向于脑肿瘤细胞的作用。体内抑制胶质瘤实验中，双修饰脂质体组的荷瘤大鼠的中位生存期显著长于单修饰及未修饰的脂质体，说明两种靶向功能基发挥了协同作用。

类似的双功能基系统还有Tf与麦胚凝集素(WGA)的配合使用[26]、他莫昔芬与WGA的配合使用[27]等，这里不再赘述。

使用两种不同作用的功能基来实现双级靶向作用时，可根据需要灵活调整两种功能基的比例，以达到脑肿瘤治疗的最佳效果，这使其明显优于单功能基修饰的双级靶向系统。但是，在纳米载体上修饰两种功能基、尤其是修饰Tf等大分子时工艺繁杂，结果的重现性也较差，实验思路的设计和实施仍需进一步改进。

3小结

如何使药物高效地穿过BBB并靶向浓集于脑肿瘤部位一直是医药领域研究的热点和难点，“双级靶向”概念的提出给相关研究带来了新的希望，同时这种思路也逐渐扩展到其他中枢神经系统疾病的靶向治疗中。在过去几年中，双级靶向纳米载体的研究取得了许多有价值的成果，使其成为前景广阔的脑肿瘤治疗策略。但是现有的双级靶向策略主要是对原有的单一靶向策略的延伸，靶向效果有待进一步的提高，而且靶向系统的制备也较为复杂，其临床应用的价值尚不可知，因此，双级靶向纳米载体尚需更深入地研究来补充、完善和验证。

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