LHRHa与八聚精氨酸共修饰载氟尿嘧啶靶向脂质体的构建及其抗前列腺癌作用

杨庆良，夏永华，何岩，张广云，宋歌

(1.河南省安阳市人民医院泌尿外科，安阳 455000；2.新乡医学院第一附属医院皮肤科，新乡 453100；3.新乡医学院第一附属医院泌尿外科，新乡 453100)

LHRHa与八聚精氨酸共修饰载氟尿嘧啶靶向脂质体的构建及其抗前列腺癌作用

杨庆良1，夏永华2，何岩3，张广云1，宋歌1

(1.河南省安阳市人民医院泌尿外科，安阳 455000；2.新乡医学院第一附属医院皮肤科，新乡 453100；3.新乡医学院第一附属医院泌尿外科，新乡 453100)

目的 构建促黄体激素释放激素类似物(LHRHa)与八聚精氨酸(R8)共修饰载氟尿嘧啶(5-FU)脂质体(LHRHa/R8-LP-5-FU)，对其前列腺癌靶向性以及治疗效果进行初步研究。方法 采用薄膜分散法制备LHRHa/R8-LP-5-FU，考察其形态、粒径、电位，并通过PC-3前列腺癌细胞定性和定量摄取实验考察其前列腺癌细胞靶向性。采用噻唑蓝(MTT)实验以及肿瘤球实验考察LHRHa/R8-LP-5-FU对PC-3细胞增殖抑制率。结果 所制备LHRHa/R8-LP-5-FU粒径为(115.0±15.2) nm，电位为(11.00±2.15) mV，5-FU的包封率(84.5±5.1)%。体外细胞摄取实验表明，PC-3细胞对LHRHa/R8-LP摄取效率分别是R8修饰脂质体(R8-LP)和LHRHa修饰脂质体(LHRHa-LP)2.8和3.2倍(P<0.01)。细胞毒性实验结果显示，以0.9%氯化钠溶液为对照，LP-5-FU、R8-LP-5-FU、LHRHa-LP-5-FU和LHRHa/R8-LP-5-FU对PC-3细胞的增殖抑制率分别为(26.4±4.5)%，(39.5±4.2)%，(48.6±3.5)%和(82.5±4.3)%(P<0.01)。LHRHa/R8-LP-5-FU对肿瘤球的生长抑制作用明显高于其他脂质体。细胞毒性实验结果与细胞摄取实验结果一致。结论 LHRHa与细胞穿膜肽共修饰载5-FU脂质体具有良好的前列腺肿瘤细胞靶向性和抗肿瘤作用，是一种潜在的治疗前列腺癌的高效给药系统。

促黄体激素释放激素类似物；八聚精氨酸；脂质体；癌，前列腺

前列腺癌是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤，在西方国家，前列腺癌是最常见的恶性肿瘤，居西方国家男性所有恶性肿瘤死亡率的首位，发病率的第2位[1]。促黄体激素释放激素受体在前列腺癌和卵巢癌表面高度表达[2-3]。脂质体是一种被广泛研究的靶向给药系统，脂质体可以进行表面修饰，可以引入聚乙二醇延长循环时间，达到长循环的效果，也可以连接配体成为主动靶向脂质体[4]。笔者将促黄体激素释放激素类似物(luteinizing hormone-releasing hormone analogues，LHRHa)和细胞穿膜肽八聚精氨酸(R8)共同连接到脂质体的表面，以氟尿嘧啶(5-FU)为模型药物，进行前列腺癌的肿瘤靶向治疗研究。

1 材料与方法

1.1 试剂 生物素修饰LHRHa(上海强耀生物公司，含量98.5%，批号：130602P)；R8(上海强耀生物公司，含量99.9%，批号：131121R)；大豆磷脂(上海太伟药业有限公司)；生物素修饰DSPE-PEG2000(美国Avanti polar lipids公司)；链霉亲和素(北京博奥森生物公司)；胆固醇(Cho，美国Sigma公司)；达尔伯克必需基本培养液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM，美国GIBCO公司)；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记磷脂(美国Avanti polar lipids公司)；DSPE-PEG2000-MAL(美国Sigma公司)；其余试剂为分析纯。前列腺肿瘤细胞(PC-3，ATCC)。

1.2 仪器 Sizer Nano ZS90型激光粒度仪及Zeta电位分析仪(英国Malvern instruments Ltd.)；H-600IV型透射电子显微镜(日本Hitachi)。

1.3 方法

1.3.1 脂质体的制备及表征 参照文献[3]方法制备LHRHa-LP-5-FU。取大豆磷脂9.96 mg、胆固醇2.0 mg、生物素修饰DSPE-PEG2000(摩尔比为90：5：5)和5-FU 1.05 mg溶于三氯甲烷溶液。抽干成膜，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)水化得到生物素修饰脂质体。取生物素修饰脂质体与过量的LHRHa混合，4 ℃震荡反应30 min，过CL4B柱，得到LHRHa-LP-5-FU。参照文献[5-6]方法合成DSPE-PEG2000-R8。取处方量的大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-R8(摩尔比为94.5：5：0.5)和5-FU溶于三氯甲烷溶液。抽干成膜，用PBS 2 mL水化得到R8-LP-5-FU。

取相同量的大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-R8、生物素修饰DSPE-PEG2000(摩尔比为89.5：5：0.5：5)和5-FU溶于三氯甲烷溶液，采用同于制备LHRHa-LP-5-FU的方法制备得到LHRHa/R8-LP-5-FU。

取适量样品用磷钨酸染色，置于透射电镜下观察脂质体的表观构象。取适量脂质体用粒度仪测定其粒径及电位，采用葡萄糖凝胶柱色谱法分离脂质体与未包载的5-FU，用高效液相色谱(HPLC)法在波长273 nm处检测5-FU含量。按照包封率(%)=W包/W投×100%计算5-FU的包封率。

1.3.2 PC-3细胞对不同脂质体的摄取考察 按照“1.3.1”项下方法，用FITC-PE取代适量大豆磷脂，制备FITC标记的脂质体。取对数生长期的细胞，以每孔5×105个的密度接种于6孔板中，37 ℃培养24 h后，每孔加入适量LHRHa-LP、R8-LP和LHRHa/R8-LP使孔中脂质体浓度为0.15 mg·mL-1，37 ℃分别孵育2 和4 h后除去含脂质体培养液，冷PBS清洗3次，0.25%胰酶消化后离心，PBS清洗3次，流式细胞仪测定细胞荧光值。

为了定性观察PC-3细胞对脂质体的摄取情况，将脂质体与PC-3细胞共同孵育4 h后，将细胞用PBS漂洗3次，加入2 μg·mL-14'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)溶液，室温孵育20 min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛溶液固定15 min，弃去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦荧光倒置显微镜观察细胞摄取。

1.3.3 噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法分析检测不同脂质体对肿瘤细胞的增殖抑制率 培养PC-3细胞并接种于96孔板中，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时加入无菌过滤后的LP-5-FU、R8-LP-5-FU、LHRHa-LP-5-FU和LHRHa/R8-LP-5-FU。将孔板移入37 ℃、二氧化碳(CO2)孵箱中培养24和48 h后取出，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，再放回孵箱中继续孵育4 h，将孔板中液体倒出，每孔加入二甲亚砜溶液200 μL，37 ℃避光振摇15 min，用荧光分光光度计在波长490 nm处测定各孔的吸光度(A)。

1.3.4 肿瘤球生长抑制实验 取对数生长期的PC-3细胞用0.125%胰酶消化后，用含血清的培养液中和胰酶，并将细胞吹打下来后离心，弃去上清液，用培养液重悬细胞后接种于用低熔点琼脂糖预处理的96孔板中，将96孔板移入37 ℃ 、CO2孵箱中培养。7 d后成长为肿瘤球。加入无菌过滤后的LP-5-FU、R8-LP-5-FU、LHRHa-LP-5-FU和LHRHa/R8-LP-5-FU。以0.9%氯化钠溶液为阴性对照组，统计肿瘤球体积大小变化情况。

2 结果

2.1 LHRHa/R8-LP-5-FU的粒径、电位以及包封率 LHRHa/R8-LP-5-FU磷钨酸染色后在电镜下观察(图1)，呈现大小比较均一的球状。激光粒度仪测得LHRHa/R8-LP-5-FU的粒径为(115.0±15.2) nm，电位为(11.00±2.15) mV，多分散系数<0.3。3种不同脂质体粒径范围接近，说明靶头的引入对脂质体的粒径没有影响。见表1。

图1 LHRHa/R8-LP-5-FU的透射电镜图(×5 000)

Fig.1 Transmission electron microscopy image of the LHRHa/R8-LP-5-FU(×5 000)

表1 不同脂质体的粒径与电位

2.2 LHRHa/R8-LP的体外细胞摄取 在PC-3细胞表面有促黄体激素释放激素受体高度表达。细胞摄取的定量实验结果见图2。PC-3细胞对LHRHa/R8-LP的摄取效率分别是R8修饰脂质体(R8-LP)和LHRHa修饰脂质体(LHRHa-LP)的2.8和3.2倍，差异有统计学意义(χ2=17.5，20.3，均P<0.01)。定性的激光共聚焦荧光倒置显微镜观察结果见图3。绿色是脂质体的FITC荧光，蓝色是DAPI染色细胞核。LHRHa/R8-LP组荧光强度显著强于R8-LP和LHRHa-LP，且3组脂质体的荧光强度都强于普通脂质体组。这与定量的实验结果一致。

图2 PC-3细胞在不同时间对不同脂质体的摄取

与LP比较，*1P<0.01；与R8-LP 和LHRHa-LP 比较，*2P<0.01

Fig.2 Uptake of different liposomes by PC-3 cells at different time points

Compared with LP，*1P<0.05；compared with R8-LP and LHRHa-LP，*2P<0.01

2.3 LHRHa/R8-LP-5-FU对肿瘤细胞的增殖抑制作用 PC-3细胞给药48 h后，以0.9%氯化钠溶液组为对照，LP-5-FU、R8-LP-5-FU、LHRHa-LP-5-FU和LP-5-FU对PC-3细胞的增殖抑制率分别为(26.4±4.5)%，(39.5±4.2)%，(48.6±3.5)%和(82.5±4.3)%。与0.9%氯化钠溶液组比较，各脂质体给药组均能有效抑制肿瘤细胞增殖，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 LHRHa/R8-LP-5-FU对肿瘤球的生长抑制作用 肿瘤球生长抑制实验结果显示，与0.9%氯化钠溶液组比较，各组脂质体均能抑制肿瘤球的生长。给药8 d后，0.9%氯化钠溶液组肿瘤球持续生长，体积增大到原体积的1.43倍，而LP-5-FU、R8-LP-5-FU、LHRHa-LP-5-FU和LHRHa/R8-LP-5-FU分别使肿瘤体积减小到原体积的83%，65%，71%和44%。与0.9%氯化钠溶液组比较，各脂质体给药组均能有效抑制肿瘤球的生长，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

3 讨论

理想的肿瘤靶向药物传递系统不仅需要在全身给药后将药物浓集在肿瘤组织，而且还需要能够特异识别肿瘤细胞，将药物高效地传递到肿瘤细胞内，从而将治疗作用最大化，并减少抗肿瘤药物的不良反应[7]。研究表明，促黄体激素释放激素受体在前列腺癌表面大量表达[2]，从而成为靶向治疗前列腺癌的潜在靶点。将LHRH修饰到载体微粒表面，制成肿瘤靶向递药微粒，通过实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention,EPR)使微粒能够在肿瘤部位靶向性聚集，提高靶向目标的药物浓度、生物利用度以及疗效，同时降低药物在非肿瘤部位的不良反应[8-9]。然而，单纯依靠LHRH修饰载体，通过被动靶向到达肿瘤部位后，可能出现受体饱和等问题。R8是由8个精氨酸组成的直链肽，能够穿过与之相接触的任何细胞的细胞膜[10]，这一特点限制了R8在全身系统给药中的应用。笔者将细胞穿膜肽R8与LHRH共同修饰到脂质体表面，首先通过肿瘤组织的EPR效应到达肿瘤组织，然后依靠LHRH识别肿瘤组织表面高度表达的LHRH受体，再利用LHRH受体介导以及R8的穿膜作用使脂质体进入肿瘤细胞，实现了肿瘤组织和肿瘤细胞的二级靶向。

Fig.3 Uptake of FITC-labeled different liposomes by PC-3 cells by confocal laser scanning microscopy(CLSM)(×200)

Fig.4 Inhibitory effect of different liposomes on PC-3 tumor ball

采用生物素-亲和素桥接系统将LHRH连接到脂质体表面，能够有效保持LHRH的生物活性。制备得到的共修饰脂质体的粒径约120 nm。纳米载体的粒径范围在10～150 nm，能够有效避开网状内皮系统的吞噬，通过EPR效应到达肿瘤组织[11]。在细胞摄取实验中，与普通脂质体相比，经过LHRHa或者R8修饰都能够显著增强PC-3前列腺癌细胞对脂质体的摄取，其中对共修饰脂质体的摄取效率显著高于LHRHa或者R8单独修饰的脂质体，这说明二者具有协同作用。MTT实验结果证实，LHRHa/R8-LP-5-FU对肿瘤细胞的增殖抑制作用最强，这是由于LHRH和R8共同修饰脂质体后，脂质体对肿瘤细胞的识别能力和入胞能力显著增强，进而增强了入胞的药物量，增强细胞毒性，抑制细胞增殖。研究表明在某些实体肿瘤组织中，由于肿瘤组织致密生长，肿瘤内部压力高且血管少，因此给药系统很难进入肿瘤组织深部[12]。本研究构建了体外肿瘤球模型模拟脂质体进入肿瘤组织后对肿瘤的生长抑制能力，结果与细胞增殖抑制实验结果相一致，相比于其他脂质体，共修饰脂质体能够显著抑制肿瘤球的生长。

综上所述，LHRHa/R8-LP-5-FU是一种很有前景的前列腺肿瘤靶向给药系统。LHRHa/R8-LP能够更加有效地将抗肿瘤药物递送至LHRH高度表达的肿瘤组织，并通过LHRHa和R8的共同作用，促进入胞，抑制肿瘤的生长。该给药系统的体内靶向性和体内疗效研究正在进行中。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.007

Preparation of LHRHa and R8 Co-modified 5-FU Loaded Liposome and Its Anti-prostate Cancer Effect

YANG Qingliang1, XIA Yonghua2, HE Yan3, ZHANG Guangyun1, SONG Ge1

(1.DepartmentofUrinarySurgery,People'sHospitalofAnyang,HenanProvince,Anyang455000,China; 2.DepartmentofDermatology,theFirstAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453100,China; 3.DepartmentofUrinarySurgery,theFirstAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453100,China)

Objective To prepare luteinizing hormone-releasing hormone analogues (LHRHa) and R8 co-modified 5-FU loaded liposome (LHRHa/R8-LP-5-FU) and investigate therapeutic effect towards prostate cancer. Methods The co-modified liposome was prepared by film-ultrasonic method.The appearance, particle size and Zeta potential were evaluated.The cellular uptake by PC-3 cellsinvitrowas used to evaluate the targeting efficiency.The anti-proliferation activity of LHRHa/R8-LP-5-FU was evaluated by MTT assay.Tumor spheroids were used to evaluate anti-tumor ability of LHRHa/R8-LP-5-FUinvitro. Results The particle diameter of the co-modified liposome was (115.0±15.2) nm with the Zeta potential of (11.00±2.15) mV.The embedding ratio of LHRHa/R8-LP-5-FU was (84.5±5.1)%.The result demonstrated that the ratio of co-modified liposome uptaken by PC-3 were 2.8 and 3.2 times higher than that of R8-LP and LHRHa-LP(P<0.01), respectively, and the cell inhibition of LP-5-FU, R8-LP-5-FU, LHRHa-LP-5-FU and LHRHa/R8-LP-5-FU were (26.4±4.5)%, (39.5±4.2)%, (48.6±3.5)% and (82.5±4.3)% (P<0.01), respectively.The inhibition of the growth of tumor sphere by LHRHa/R-LP-5-FU was obviously higher than that of the other liposome groups. The experimental results of cell toxicity were consistent with the experimental results of cell uptake. Conclusion The co-modified liposome may serve as a promising prostate cancer delivery system for antitumor agents.

Luteinizing hormone-releasing hormone analogues; R8; Liposome; Cancer, prostate

2013-11-11

2014-05-15

杨庆良(1977-)，男，山东阳谷人，主治医师，在读硕士，研究方向：泌尿道肿瘤。电话：0372-3335638，E-mail：751195651@qq.com 。

R979.1；R965

A

1004-0781(2015)01-0030-05