FSHβ基因-211G→T多态性与多囊卵巢综合征的相关性研究

宋倩倩，杨梦云，赵学科，邱慧玲

多囊卵巢综合征(polysistic ovary syndrome，PCOS)是育龄期妇女常见的异质性内分泌疾病，发病率5% ～10%［1］。PCOS临床表现复杂多样，如月经稀发甚至闭经、无排卵、高雄激素血症、胰岛素抵抗等，其并发症也表现各异，不仅2型糖尿病、糖耐量受损及代谢综合征的发生率较高［2-3］，而且子宫内膜癌、妊娠及新生儿并发症、心血管病等的发生风险也高于正常人群［4-6］，PCOS的病因至今尚未阐明。基因多态性研究是近年来学者们研究的热点，多数学者认为PCOS的发病可能与基因调控有关。卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)由α和β亚基组成，β亚基具有特异性并使FSH具有生物活性，由卵泡刺激素β亚基(follicle stimulating hormone β-subunit，FSHβ)基因编码，FSH 对卵泡生长发育及排卵以及雄激素转化为雌激素起到重要的作用。而PCOS患者内分泌特征有:雄激素过多、雌激素过多、黄体生成素与卵泡刺激素比值(luteinizing hormone/follicle stimulating hormone，LH/FSH)增大等。因此，FSHβ基因是PCOS病因研究的相关因素，但目前尚缺乏FSHβ-211G→T与PCOS的相关性研究。本研究特探讨FSHβ-211G→T与PCOS的关系如下。

1 对象与方法

1.1 对象 病例组:收集2013年3－8月就诊于厦门解放军174医院妇科的18～35岁PCOS 100例，均为福建省汉族人，诊断标准参照2003年欧洲人类生殖协会和美国生殖医学协会推荐的诊断标准［7］，即:①稀发排卵或无排卵;②雄激素水平升高的临床表现和(或)高雄激素血症;③B超监测下的卵巢多囊改变，一侧或双侧卵巢中直径2～9 mm的卵泡数≥12个，和(或)单侧卵巢体积增大＞10 mL;符合以上3条中的2条，并排除其他致雄激素水平升高的病因，包括先天性肾上腺皮质增生、分泌雄激素的肿瘤、库欣综合征等，以及其他引起排卵障碍的疾病，如高催乳素血症、垂体或下丘脑性闭经、卵巢早衰、甲状腺功能异常等。对照组:选择同期因输卵管因素(慢性输卵管炎)不孕而就诊的女性154例，入选标准为:年龄18～35岁、福建省汉族人;月经规律(25 d＜月经周期＜35 d);B超监测正常排卵;均无慢性疾病;至少3个月未服用过激素类药物。本研究经174医院伦理委员会批准，获得每位研究对象的知情，并签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 DNA提取试剂盒(Roche公司)，DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司)，部分激素检测试剂盒(瑞士 Roche公司);Unicel DXI 800化学发光免疫分析仪及配套生殖激素检测试剂(BECKMAN COULTER公司)，Bioer lifepro PCR扩增仪(北京东方安诺生化科技有限公司)，Cavoy电泳仪(上海京工实业有限公司)，ABI3730测序仪(厦门闽博生物技术有限公司)。

1.3 实验方法 收集入选对象的年龄、血压、腹围、身高、体重、体质指数、月经史及B超监测排卵情况。所有入选对象至少3个月未服用过激素类药物，均于月经来潮第2～3天(闭经者任何时期)，禁食12 h，抽取静脉血，检测血清FSH、LH、雌二醇(estradiol，E2)、孕激素(progesterone，P)、睾酮(testosterone，T)、泌乳素(prolactin，PRL)、促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)、空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)，以及空腹总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein，HDL)、血清硫酸脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate，DHEAS)、性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)。以稳态模型评估-胰岛素抵抗指数［8］(HOMA-IR)=(FPG×FINS)/22.5。并于同样条件下各抽取静脉血5 mL，EDTA抗凝，于－80℃储存。

提取全血DNA，PCR总反应体积20 μL，上下游引物(l1 μmol/L)各 1 μL、DNA 模板 4 μL、超纯水9.4 μL、10 × Easytaq Buffer 2 μL、2.5 mM dNTPs 2 μL、Easytaq DNA Polymerase 0.6 μL;FSHβ-211G→T基因引物序列［英潍捷基(上海)有限公司合成］:上游引物为:5'-GGTAGTGATTATGGTTCTCCCTCAC-3'，下游引物为:5'-CCACTTGAAAACGGTAGATGC-3'。PCR扩增程序为:94℃预变性4 min，94℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35 次，72℃最后延伸5 min，扩增结束后存于4℃。取PCR扩增产物 2 μL，在琼脂糖凝胶(1.2%)上，用稳压100 V，电泳15 min，于凝胶成像分析仪上成像，进行基因测序，获得突变位点基因序列，与已获取的基因序列比对后，根据测序图进行基因型鉴定。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，计量资料组间比较若符合正态分布采用t检验，不符合正态分布则采用Mann-Whitney U检验;计数资料以例(率)［n(%)］表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增及测序结果 PCR扩增目的基因片段长811 bp，于凝胶成像分析仪上成像见图1。基因测序结果示FSHβ-211G→T基因变异有两个基因型G/G及G/T(图2)。

图1 FSHβ-211G→T基因PCR产物凝胶成像

图2 病例组和对照组FSHβ-211G→T基因测序结果

2.2 病例组和对照组的FSHβ-211G→T的基因型及等位基因分布 经Hardy-Weinberg平衡检验［9］，两组等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。在PCOS人群中FSHβ-211G→T突变 GT基因型频率为14.0%，对照组中 GT基因型频率为6.5%，FSHβ-211G→T的基因型在两组中的分布差异有统计学意义(P ＜0.05，表1)。

表1 两组的FSHβ-211G→T的基因型及等位基因分布比较

2.3 不同FSHβ-211G→T基因型对病例组及对照组内分泌代谢指标的影响 携带GT基因型的患者较GG基因型患者具有低FSH水平及高LH/FSH比值(P＜0.05);同时在对照组中发现具有GT基因型者较GG基因型者具有高LH/FSH比值及高TC水平(P ＜0.05，表 2)。

3 讨论

PCOS是育龄期妇女一种常见的异质性内分泌疾病，临床表现及近远期并发症复杂多样［2-6］，严重影响女性生殖及内分泌健康。但PCOS的病因至今尚未阐明，目前多数学者认为PCOS的发病可能与基因调控有关。人体内基因具有自然变异和多态性的特征，基因学研究有助于了解人类复杂疾病。最近被确认的FSHβ-211G→T，位于FSHβ基因启动子区的第 211 个位点(rs10835638)［10］。有研究［11-12］表明，FSHβ-211G→T对生育期女性的下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamic pituitary ovarian axis，HPO)有一定的影响，FSHβ基因和FSH受体(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)基因联合突变可能会影响血清FSH水平。有研究［13］认为女性HPO轴有影响的基因变异对PCOS的相关表型也有一定的影响。

本研究发现FSHβ-211G→T基因变异具有两个基因型GG及GT，在PCOS人群中FSHβ-211G→T突变GT基因型频率为14.0%，T等位基因频率高于对照组(PCOS为7.0%，对照组为 3.2%)，两组间FSHβ-211G→T基因型分布存在差异(P＜0.05)，表明该单核苷酸位点多态性对PCOS的发病易感性有影响，并明确了FSHβ-211G→T基因多态性对PCOS的内分泌代谢有一定的影响。有学者研究发现［12］，FSHβ-211G→T突变基因T与高FSH水平及高LH水平相关。但本研究发现，FSHβ-211G→T与血清FSH水平之间的关系明显不同于先前的研究，这可能与不同人种、不同地区群体的基因突变频率差异及研究设计方案、分析方法的不同有关。在PCOS患者中FSHβ-211G→T多态性对 FSH及LH/FSH比值有影响，携带GT基因型的患者较GG基因型患者具有低FSH水平及高LH/FSH比值(P＜0.05)，同时TC水平也有上升趋势;在对照组中携带GT基因型者较GG基因型者具有高LH/FSH比值及高TC水平(P＜0.05)，而FSH水平也有下降趋势;该基因多态性对 LH、FPG、FINS、LDL、HDL、DHEAS、SHBG等指标无明显影响。因此，笔者推断FSHβ基因启动子区的多态性通过影响FSH、TC水平来影响PCOS的内分泌代谢。根据Falck在1959年提出的学说［14］:在颗粒细胞中，FSH与颗粒细胞上的FSHR结合，激活颗粒细胞内的芳香化酶活性，将雄激素转化为雌激素。因此笔者推测，FSHβ-211G→T通过影响FSH水平，改变PCOS体内雄激素和雌激素的水平，引起激素水平的紊乱，以致PCOS临床内分泌代谢的变化，最终导致PCOS的发生。总之FSHβ-211G→T基因多态性对PCOS的发病易感性及临床内分泌特征有影响，FSHβ-211G→T基因多态性可能是PCOS发病的原因之一。

表2 病例组与对照组不同FSHβ-211G→T基因型的内分泌代谢指标比较(±s)

表2 病例组与对照组不同FSHβ-211G→T基因型的内分泌代谢指标比较(±s)

注:与本组GG基因型比较，*P＜0.05

指标 病例组(n=100)对照组(n=154)GG GT FSH(mIU/mL) 6.77 ±1.93 5.18 ±1.41*GG GT 1.40 ±0.38 1.55 ±0.33 1.53 ±0.35 1.73 ±0.55 7.36 ±2.37 6.76 ±1.21 LH(mIU/mL) 10.78 ±6.53 11.91 ±6.85 4.37 ±1.99 7.45 ±7.20 LH/FSH 1.65 ±0.93 2.31 ±1.14* 0.65 ±0.37 1.06 ±0.87*E2(pg/mL) 39.98 ±21.45 35.71 ±18.67 39.99 ±24.06 40.40 ±19.46 T(ng/mL) 0.62 ±0.35 0.56 ±0.14 0.60 ±2.84 0.37 ±0.13 P(ng/mL) 0.91 ±0.72 0.79 ±0.40 1.18 ±2.59 0.85 ±0.30 PRL(ng/mL) 14.86 ±6.72 28.23 ±43.88 16.72 ±8.46 15.80 ±4.84 TSH(μIu/mL) 2.68 ±3.39 4.07 ±5.89 2.21 ±1.09 1.75 ±0.58 SHBG(nmol/L) 53.09 ±85.58 41.65 ±72.40 63.71 ±63.24 86.91 ±116.27 DHEAS(μg/dL) 306.95 ±60.34 321.50 ±63.67 308.41 ±138.31 326.52 ±113.69 FPG(mmol/L) 4.85 ±0.53 4.94 ±0.73 4.69 ±0.50 4.69 ±0.43 FINS(μU/mL) 11.27 ±6.75 13.08 ±8.88 8.31 ±7.82 8.16 ±3.50 HOMA-IR 2.44 ±1.64 2.88 ±2.50 1.76 ±1.69 1.71 ±0.78 TC(mmol/L) 4.74 ±0.77 5.17 ±0.85 4.86 ±0.79 5.43 ±0.75*TG(mmol/L) 1.76 ±4.30 1.34 ±4.32 0.98 ±0.74 0.96 ±0.70 LDL(mmol/L) 2.83 ±0.71 3.07 ±0.71 2.87 ±0.05 3.17 ±0.77 HDL(mmol/L)

本研究对FSHβ-211G→T与PCOS的相关性进行首次研究，选取的人群仅为中国福建汉族女性人群，具有一定的局限性，有待对更多地区、更多人种进行研究。

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