非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药分子靶向研究进展
2015-12-08张亚龙尤嘉琮
张亚龙,尤嘉琮
天津医科大学总医院,天津市肺癌研究所,天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室,天津 300052,
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的发病率最高,死亡率居于各类肿瘤之首[1]。从循证医学的角度分析,针对NSCLC的治疗应根据患者的具体情况,如患者机体状况、病理分型以及肿瘤侵犯部位及发展情况进行综合的评价,从而制订出合理有效的治疗方案。既往的研究发现,在约40%~80%的NSCLC患者组织中存在表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的过度表达[2],同时EGFR突变也多发生于NSCLC患者中。选择以EGFR作为靶点治疗NSCLC患者,在临床上取得了较为理想的效果。早期针对该靶点的药物主要可分为单克隆抗体以及小分子的抑制剂,其中以吉非替尼为代表的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)在上市初期对具有EGFR突变的NSCLC患者的疗效十分显著。但长期的临床观察发现,有一部分患者对EGFR-TKIs药物治疗并不敏感,部分会在治疗一段时间之后,发生敏感性逐渐降低直至最后出现耐药性。目前,EGFR-TKIs仍然是治疗NSCLC的理想药物,靶向耐药有关的分子研究辅助EGFR-TKIs治疗NSCLC是一个新的重要的研究内容。
1 EGFR-TKIs作用途径
EGFR属于表皮生长因子基因(ErbB)受体家族,是跨膜蛋白的一种,由1186个氨基酸组成,分子质量为170kD。EGFR包括三个区域:胞外配体结合区、酪氨酸激酶活性区和跨膜区。胞外配体结合区的主要结合区域位于294至543位氨基酸。酪氨酸激酶活性区又分为近膜亚区、酪氨酸激酶亚区和碳端亚区,其中的酪氨酸激酶亚区含有ATP的结合位点,EGFR-TKIs的竞争结合靶点之一,通过与此靶点的结合可阻断配体与受体结合后的信号转导[3]。跨膜区可将受体固定于细胞膜上。
当EGFR的胞外区域和其配体结合,例如EGF或者转化生长因子-α(transforming growth factor-α,TGF-α),可与其他EGFR或者HER等家族成员形成二聚体,使得EGFR自身可以进行自主性磷酸化,同时激活主要的酪氨酸残基。在此形成的磷酸化EGFR进一步激活下游与细胞存活、细胞增殖和细胞凋亡有关通路,如P13K/AKT/mTOR,RAS/RAF/MAPK,JAK/STAT等通路[4-11]。由EGFR基因的突变引起的信号通路的结构性激活已经被证实与NSCLC肿瘤的形成、发展以及不良预后密切相关[12]。EGFR激活突变区域主要位于酪氨酸激酶区的18-21外显子区域,主要包括19外显子的缺失突变(delE746-A750),缺失几率为45%;21外显子易出现点突变(L858R),其突变几率为40%~45%;18外显子出现点突变(G791X)几率为5%;20外显子主要以插入突变为主,几率为5%[13]。EGFR所出现的基因突变中,19外显子突变发生在EGFR与ATP结合区域,突变造成ATP的结合位点发生改变;21外显子的L858R突变,促使酪氨酸激酶长期处于活化状态,而L719S突变引起非活化构象去稳定化,结果造成EGFR持续被激活,使得原先的ATP结合位点与TKI结合早于ATP,由此阻断下游与细胞生长有关的信号传导。以上EGFR发生的突变这些突变均能增加癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性。有研究发现,吉非替尼、埃罗替尼等EGFR-TKIs药物对EGFR突变患者的有效率高达75%[14]。因此,在临床采用吉非替尼治疗NSCLC的一个重要依据便是观察患者是否出现EGFR突变。
1.1 EGFR-TKIs原发性耐药的分子靶向研究 在EGFR-TKIs成为治疗NSCLC患者的主要药物之后,耐药性的出现使得治疗又出现一定的局限性。多数的具有EGFR突变的肿瘤患者,在药物初始治疗后的12个月左右出现了耐药性。目前已有多种EGFR-TKIs耐药相关诱因被证实,包括EGFR自身耐药性突变,T790M突变,上皮间质转化因子(mesenchymal-epithelial transition factor,MET)原癌基因扩增及其蛋白过度表达,EGFR配体中又存在HGF和PTEN缺失,KRAS、BRAF和HER-2突变,上皮细胞向间质细胞转化,细胞生长相关信号通路信号缺失,AXL过表达等因素[15-21]。针对上述的耐药因素,早有研究人员根据其耐药机制将其分为原发性耐药与获得性耐药[22],其中获得性耐药又分为对EGFR具有依赖性的耐药与不具有依赖性的耐药[23],但二者均包含有组织或细胞内的基因表达改变及突变,近期在以往关于耐药基因研究的基础上又发现新的与耐药相关的基因。
Balak MN等[22]研究者发现,部分患者在初次使用EGFR-TKIs药物治疗一段时间后,对于症状及存活率并无明显改善,这部分患者即可被视为对EGFR-TKIs原发性耐药。并且在EGFR突变的NSCLC患者群体中,此类患者也占有一定比例。早期针对原发性耐药原因的研究发现,同时出现的药敏突变与基因突变,与EGFR信号传导有关的基因发生突变使细胞信号传导中断,患者机体免疫方面的变化等均会导致NSCLC患者原发性耐药,KRAS基因突变也可以导致EGFR-TKIs原发耐药。SOX2基因与EGFR-TKIs原发性耐药密切相关,使用PI3K/Akt抑制剂可以抑制SOX2基因表达,从而增加NSCLC细胞对EGFR-TKIs的敏感性[24]。Nozaki等[25]研究发现,在EGFR-TKIs原发耐药性肺癌细胞中,DDX3X作为一种ATP依赖性的RNA解旋酶,其表达可以促进SOX2表达,出现上皮细胞向间质细胞转化,使癌细胞出现如细胞独立增殖分化能力等类似肿瘤干细胞的表型,而由此增殖分化出的细胞均具有EGFR-TKIs抗性。CRIPTO1是EGF-CFC家族一员,在对EGFR-TKIs耐药的EGFR突变型NSCLC患者中检测到CRIPTO1表达显著升高,当敲除CRIPTO1后对厄洛替尼耐药的细胞出现了厄洛替尼敏感性表型[26],说明CRIPTO1可能是治疗EGFRTKIs耐药性患者的一个潜在靶点。
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是纤维蛋白溶酶原家族成员,具有活化MET的功能。HGF/MET通路可参与血管、组织形成以及免疫活性调节。有研究发现HGF/MET通路参与到EGFR突变的NSCLC原发性耐药与继发性耐药中。在EGFR-TKIs原发性耐药的细胞系中,检测到HGF过度表达而推测HGF可能会通过激活MET,使其介导下游的PI3K-Akt信号通路激活,降低EGFRTKIs对信号传导的抑制能力[27]。通过建立对EGFRTKIs耐药MET激活的细胞系研究发现,在MET大量被激活的细胞中,EGFR-TKIs对癌细胞的细胞毒性作用将大大削弱[28]。近期研究发现,HGF可以使酪氨酸激酶失活,继而造成EGFR-TKIs的原发性耐药,并且HGF还可以促使肿瘤蛋白与EGFR之间的相互作用,于是在治疗EGFR-TKIs原发耐药性治疗预先使用HGF/MET的抑制剂可能会防止耐药现象的发生[29]。
1.2 EGFR-TKIs获得性耐药的分子靶向研究 获得性耐药是目前治疗EGFR突变的NSCLC患者主要障碍之一,也是目前NSCLC治疗无论是无进展生存期短还是生存率低的主要原因。EGFR-TKIs获得性耐药是指经过EGFR-TKIs治疗后,一般在6~14个月左右肿瘤出现复发或者出现新的进展。
由于基因二次突变是在用药过程中产生而被检测到的,所以被认为是获得性耐药的首要机制。T790M突变是最常见的EGFR-TKIs获得性耐药性诱因,在EGFR基因的CpG二核苷酸出现了碱基C向T的转换。其机制主要是由于T790M突变是EGFR基因20外显子第790位点由一个庞大体积的蛋氨酸(M)替代苏氨酸(T),出现了位阻效应,减弱了与EGFR的ATP结合力,另外T790M突变增加了EGFRL858R突变体与ATP的亲和力,而产生对TKI的获得性耐药[30]。在TKI耐药性的EGFR突变患者中T790M出现的几率高达50%[31]。有研究发现,T790M可直接影响药物发挥作用,当患者被检测到出现T790M突变后,即出现对厄洛替尼耐药性现象,但当突变只出现在第19位外显子时,耐药性情况则可能出现逆转[32]。基于此现象,靶向T790M突变出现了所谓第三代治疗EGFR-TKIs耐药性药物AZD9291,它是一种单苯胺基嘧啶复合物,已经在临床上被证实可以逆转EGFR-TKIs耐药性,对于具有EGFR突变耐药性的NSCLC患者具有良好效果[33]。EGFR和AKT蛋白均是Hsp90的靶向蛋白,Hashida S等发现[34],采用Hsp90抑制剂NVP-AUY922可以通过改变TKIs获得性耐药NSCLC细胞的细胞周期,抑制EGFR突变的NSCLC细胞生长,对EGFR-TKIs出现的获得性耐药具有很好的治疗效果。
随着表观遗传学发展,新的研究发现在CpG二核苷酸的胞嘧啶甲基化(5-methylcytosine,5-mC)与EGFR-TKIs的耐药性也有密切关系。Fujii A等研究发现[35],在18例NSCLC肿瘤组织、7例发生淋巴结转移的NSCLC组织以及4株NSCLC细胞的EGFR基因790位密码子均出现了5-mC,说明CpG的二核苷酸的甲基化与EGR-TKI获得性耐药密切相关,可能是辅助治疗NSCLC患者的一个潜在靶点。
2 MET基因表达与突变
肝细胞生长因子(hepatocyte,HGF)是酪氨酸激酶受体c-MET的配体,由此活化的HGF/c-MET信号通路是由HGF作用于c-MET,引起一系列信号转导蛋白的酶促反应,诱发一系列与细胞增殖、迁移和血管发生等一系列生物效应。首次提出的MET原癌基因扩增与EGFR-TKIs耐药性有关是在构造吉非替尼耐药细胞株模型时发现的。病理研究发现,采用EGFR-TKIs治疗EGFR突变的NSCLC患者,在出现耐药性后对其肿瘤标本进行遗传分析发现,MET基因出现扩增现象,同时还发现肿瘤具有上皮细胞向间充质细胞转化现象出现,说明二者可能与NSCLC后期治疗的耐药性有关[36]。荧光原位杂交实验中MET阳性肺腺癌患者较MET阴性患者具有较短的无进展生存期与总生存率,单变量分析发现METFISH阳性结果与NSCLC患者的生存及预后具有密切关系。因此,通过分析MET基因状态可用于确定EGFR-TKI治疗情况[37]。
在EGFR-TKIs获得性耐药患者中,有超过13%的患者检测到MET基因扩增[38],而且在部分NSCLC细胞株中也发现MET出现过表达现象[39]。尤其是初始对吉非替尼的敏感性肺癌细胞HCC827中,通过MET扩增表现出了对吉非替尼的耐药性[40]。MET等相关基因扩增通常会对EGFR突变的获得性耐药患者产生影响,有研究发现对厄洛替尼和吉非替尼耐药的肺腺癌患者中有超过21%的患者出现MET基因扩增,而非EGFR-TKIs治疗的患者中出现MET扩增的概率仅为3%[38]。另有研究表明,EGFR出现T790M突变的患者中也有可能同时存在MET基因扩增,表明在EGFR获得性抗性患者中可以同时存在两种基因突变[41]。MET扩增发挥生物学效应主要是通过使ERBB3蛋白发生磷酸化,继而激活PI3K/AKT通路,将细胞生存信号向下游传递,并且即使在使用EGFR-TKIs时该通路依然可以发挥信号传递作用[42]。所以如果同时使用EGFR-TKIs与MET抑制剂可能会阻断PI3K/AKT通路,利于EGFR-TKIs发挥抑制癌症进展,这可能是一个潜在的治疗NSCLC患者获得性耐药的方向。
3 免疫及其他变化所致获得性耐药
人们已经发现了机体免疫变化与多种疾病有关,于是有研究者构建了EGFR-TKIs获得性耐药的H1650GR(吉非替尼耐药性)细胞,通过RNA序列分析及单核苷酸多态性阵列分析发现该细胞中与细胞免疫反应有关基因的表达出现不同程度的改变[43]。程序性死亡分子1及其配体(programmed death-1/ligand,PD-1/PD-L1)是一对负性免疫共刺激分子,具有抑制淋巴细胞功能和诱导活化的淋巴细胞凋亡,在自身免疫耐受及防止自身免疫性疾病等作用。肿瘤细胞表面表达PD-L1,可与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1分子结合,抑制淋巴细胞的功能及细胞因子的释放,并诱导淋巴细胞凋亡,从而抵抗淋巴细胞的杀伤作用,最终导致肿瘤发生免疫逃逸。Lin等[44]利用免疫组化技术检测了56例患者肿瘤样本的PD-L1、PD-1的表达情况,其中二者的阳性率分别为53.6%和32.1%。其中PD-L1阳性患者在经过EGFR-TKI治疗后,在无进展生存期时间、总生存期等方面均优于PD-L1阴性患者,但在PD-1患者中则观察不到类似情况,可以推测EGFR突变阳性的NSCLC患者适用于PD-1/PDl-1的免疫治疗,PD-L1可能为辅助EGFR-TKIs治疗NSCLC患者的潜在生物靶标。XAGE1(GAGED2a)是一种癌症抗原,有超过40%的肺腺癌患者出现其表达。有研究发现[45],在EGFR突变患者体中,如果具有XAGE1(GAGED2a)的抗体,则总生存期会优于无XAGE1(GAGED2a)抗体的患者,提示可通过设计针对XAGE1(GAGED2a)抗原的特异性抗体的方式,采用免疫治疗EGFR突变的NSCLC患者。免疫研究发现针对EGFR的T790M突变存在新的限制性T细胞抗原表位,包括发生甲硫氨酸残基突变的T790M、T790M-5、T790M-7等均可能是治疗EGFR-TKI耐药性患者的潜在靶点[46]。以上研究表明,在临床治疗EGFR-TKIs耐药性的NSCLC患者的同时,采用免疫抑制剂等免疫治疗手段,辅助或者直接用于临床治疗将是一个很有前景的研究方向。
获得性耐药方面,除了T790M突变与MET基因扩增外,新的获得性耐药的诱因仍然处于积极探索中。研究发现,长链非编码RNA GAS5在EGFRTKIS耐药性细胞中的表达显著低于EGFR-TKIs敏感性细胞,并且GAS5过表达与EGFR通路的激活以及胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)呈现负相关性,表明GAS5可能是治疗EGFR-TKIs获得性耐药的一个潜在靶点[47]。
综上所述,目前采用EGFR-TKIs靶向治疗NSCLC患者仍然属于较为有效的治疗手段,可以使患者免受传统化疗手段所带来的痛苦。但在初期对EGFR-TKIs敏感性阶段的治疗后,耐药性问题的出现困扰了NSCLC患者的继续治疗。随着分子生物学的发展,与耐药性有关的基因不断被挖掘,包括当前研究热点-长链非编码RNA也与EGFR-TKIs的耐药有关。由于研究发现众多基因、蛋白和信号通路等均参与同一种或者多种肿瘤的发生和发展,所以尽可能的发现与EGFR-TKIs耐药有关的分子生物学标志物将有利于寻找靶向治疗NSCLC患者EGFRTKIs耐药性的治疗策略,阻断治疗过程中出现的耐药,而为治疗NSCLC患者带来新的机遇。
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