细叶石仙桃乙酸乙酯部位化学成分的分离与鉴定

刘 量, 王 委, 殷启蒙, 严 鑫, 黄怡新, 樊逸云, 范 云, 邵梦楠, 倪晨晖, 刘 涛

(扬州大学医学院, 江苏 扬州 225009)



细叶石仙桃乙酸乙酯部位化学成分的分离与鉴定

刘 量*, 王 委, 殷启蒙, 严 鑫, 黄怡新, 樊逸云, 范 云, 邵梦楠, 倪晨晖, 刘 涛

(扬州大学医学院, 江苏 扬州 225009)

采用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱及半制备高效液相色谱等方法对细叶石仙桃进行分离纯化,研究细叶石仙桃乙酸乙酯部位的化学成分,并运用核磁共振波谱法鉴定化合物的结构. 结果表明,从细叶石仙桃乙酸乙酯部位分离得到的6种化合物分别是1,5-二羟基-2,7-二甲氧基-9,10-二氢菲(Ⅰ)、佛手柑内酯(Ⅱ)、甲氧基欧芹酚(Ⅲ)、异香草酸(Ⅳ)、阿魏酸二十六酯(Ⅴ)和二十四亚甲基环阿尔廷醇(Ⅵ),且化合物Ⅰ～Ⅴ为首次从该植物中分离得到.

细叶石仙桃; 分离纯化; 化学成分

细叶石仙桃(PholidotacantonensisRolfe.)是中药小石仙桃的基源植物,为兰科石仙桃属,以干燥全草或假鳞茎入药,主要分布在湖南、贵州、重庆等地,具有清热凉血、滋阴润肺和解毒等功效[1]. 细叶石仙桃资源丰富,民间应用历史悠久,可用于多种炎症的治疗且疗效确切,具有潜在的开发应用前景.目前关于细叶石仙桃的化学成分和药理作用方面的报道较少,仅李建晨[2],李斌[3]等从细叶石仙桃中分离得到以9,10-二氢菲、菲醌、联苄为主的十几种化合物. 9,10-二氢菲类为石仙桃属植物的特征性成分,且广泛存在于该属植物中[4-7]．9,10-二氢菲类成分具有抗肿瘤[8]、抗感染[9-10]、抗氧化[11]等多种生物活性,研究价值颇高. 本课题组拟利用多种色谱方法从细叶石仙桃的乙酸乙酯部位分离提取各化合物,然后运用核磁共振波谱法进行结构鉴定,以期丰富细叶石仙桃化学成分的相关研究成果,并为深入研究和开发应用提供理论依据．

1 仪器与材料

Avance 600型核磁共振仪(Bruker公司,瑞士);LC 3000型高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司,北京);Trace DSQ II气相色谱-质谱联用仪、LCQ Deca XP Max液相色谱-质谱联用仪(Thermo公司,美国);半制备色谱柱Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ(10 mm×250 mm, 填料粒径5 μm, Nacalai Tesque公司,日本); Sephadex LH-20色谱柱(Parmacia Bioteck公司,美国);ODS色谱柱(40～63 μm, Merck公司,德国);硅胶(孔径为0.074～0.147 mm和0.048～0.074 mm, 即100～200目和200～300目)、薄层层析硅胶H和硅胶GF254(青岛海洋化工厂,青岛).

高效液相色谱用色谱甲醇(体积分数≥99.8%, 国药集团化学试剂有限公司,色谱纯);分离纯化用石油醚、乙酸乙酯、丙酮和氯仿(体积分数≥99%,国药集团化学试剂有限公司,分析纯);工业乙醇(体积分数为95%,上海凌峰化学试剂有限公司,工业纯).

实验所用细叶石仙桃(PholidotacantonensisRolfe.)的带根全草,于2014年3月采集自浙江丽水,凭证标本(No. XYSXT20140328) 存放于扬州大学医学院药学系标本室.

2 提取与分离

称取细叶石仙桃干燥带根全草15 kg,粉碎,参照文献[12]中药材的提取和萃取方法,用体积分数为95%的乙醇在85 ℃下回流提取4次,每次2 h,提取液经过滤后减压回收溶剂,得总浸膏.待总浸膏中乙醇自然挥发,加入10倍体积的蒸馏水进行分散,得到水分散液,分别用等体积的乙酸乙酯、正丁醇依次萃取水分散液4～6次,得到乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位.称取乙酸乙酯部位浸膏780 g,经硅胶柱色谱分离,然后用V(二氯甲烷)∶V(甲醇)为100∶0～0∶100进行梯度洗脱得到18个流分(Fr.1, Fr.2, …, Fr.18); Fr.2分别经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、ODS柱色谱分离纯化得化合物Ⅵ(39 mg); Fr.4分别经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱分离,制备薄层纯化得化合物Ⅲ(30 mg)和Ⅴ(22 mg); Fr.5分别经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱分离,得到化合物Ⅰ(320 mg)、Ⅱ(450 mg)和 Ⅳ(130 mg).

3 结构鉴定

化合物Ⅰ: 无色片晶(丙酮); EI-MSm/z272 [M]+;1H-NMR(acetone-d6, 600 MHz)δ: 8.53(1H,s,5-OH),7.90(1H,d,J=9.0 Hz, H-4), 7.25(1H, s, 1-OH), 6.80(1H,d,J=9.0 Hz, H-3), 6.44(1H, d,J=2. 4 Hz, H-8), 6.40(1H, d,J=2.4 Hz, H-6), 3.85(3H, s, 7-OCH3), 3.75(3H, s, 2-OCH3), 2.77(2H,m,CH2), 2.67(2H,m,CH2);13C-NMR(acetone-d6, 150 Hz)δ: 143.0(C-1), 146.2(C-2), 109.1(C-3), 120.3(C-4), 127.9(C-4a), 115.9(C-4b), 156.3(C-5), 101.7(C-6), 159.6(C-7), 106.0(C-8), 141.8(C-8a), 31.2(C-9), 22.3(C-10), 124.7(C-10a), 56.3(2-OCH3),55.4(7-OCH3). 以上数据与毕志明等[7]256报道的1,5-二羟基-2,7-二甲氧基-9,10-二氢菲的数据基本一致, 故鉴定为1,5-二羟基-2,7-二甲氧基-9,10-二氢菲.

化合物Ⅱ: 白色针晶(氯仿); EI-MSm/z216 [M]+;1H-NMR(acetone-d6, 600 MHz)δ: 8.21(1H,d,J=9.6 Hz, H-4), 7.87(1H,br s, H-2′), 7.32(1H, s, H-8), 7.16(1H, br s, H-3′), 6.25(1H, d,J=9.6 Hz, H-3), 4.34(3H, s, 5-OCH3);13C-NMR(acetone-d6, 150 Hz)δ: 160.9(C-2), 113.4(C-3), 140.0(C-4), 150.9(C-5), 113.6(C-6), 159.4(C-7), 94.0(C-8), 153.9(C-9), 107.1(C-10), 146.3(C-2′), 106.4(C-3′), 60.9(5-OCH3). 以上数据与孙希彩等[13]报道的佛手柑内酯的数据基本一致, 故鉴定为佛手柑内酯.

化合物Ⅲ: 无色针晶(氯仿); EI-MSm/z244 [M]+;1H-NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 7.61(1H,d,J=9.0 Hz,H-4),7.29(1H,d,J=8.4 Hz, H-5), 6.83(1H,d,J=8.4 Hz,H-6), 6.22(1H,d,J=9.6 Hz, H-3), 5.23(1H,t,J=7.2 Hz,H-2′),3.91(3H,s,7-OCH3), 3.53(2H,d,J=7.8 Hz, H-1′), 1.84(3H,s,3′-CH3),1.67(3H,s,3′-CH3);13C-NMR(CDCl3, 150 MHz)δ: 160.4(C-2), 113.1(C-3), 144.0(C-4), 126.4(C-5), 107.6(C-6), 161.6(C-7), 118.1(C-8), 153.0(C-9), 113.2(C-10), 22.1(C-1′), 121.3(C-2′), 132.8(C-3′), 18.1(3′-CH3), 26.0(3′-CH3), 56.2(7-OCH3). 以上数据与孙希彩等[13]2046报道的甲氧基欧芹酚的数据基本一致, 故鉴定为甲氧基欧芹酚.

化合物Ⅳ: 白色粉末(氯仿); ESI-MSm/z167 [M-H]-;1H-NMR(acetone-d6, 600 MHz)δ: 7.58(1H,d,J=2.4 Hz, H-2), 7.57(1H, dd,J=7.8, 2.4 Hz, H-6), 6.91(1H,d,J=7.8 Hz, H-5), 3.90(3H,s,4-OCH3);13C-NMR(acetone-d6, 150 MHz)δ: 125.0(C-1), 115.6(C-2), 148.1(C-3),152.1(C-4),113.6(C-5),123.0(C-6),56.4(4-OCH3),170.0(COOH)．以上数据与杨素珍等[14]报道的异香草酸的数据基本一致,故鉴定为异香草酸.

化合物Ⅴ: 白色粉末(乙酸乙酯); EI-MSm/z558 [M]+;1H-NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 7.63(1H,d,J=15.6 Hz, H-7), 7.08(1H,dd,J=7.8, 1.8 Hz, H-6), 7.05(1H,d,J=1.8 Hz, H-2), 6.93(1H,d,J=7.8 Hz, H-5), 6.31(1H,d,J=15.6 Hz, H-8), 4.21(2H,t,J=6.6 Hz, OCH2CH2), 3.93(3H,s,OCH3),1.71(2H,m,OCH2CH2), 1.27[46H,br s,(CH2)23],0.90(3H,t,J=7.2 Hz,CH3);13C-NMR(CDCl3, 150 MHz)δ: 14.4,23.0,26.3,29.0,29.6,29.6,29.8,29.9,29.9,30.0,32.2,56.2,64.9,109.6,115.0,116.0,123.3,127.3,144.9,147.0,148.2,167.6. 以上数据与王国艳等[15]报道的阿魏酸二十六酯基本一致,故鉴定为阿魏酸二十六酯.

化合物Ⅵ: 白色粉末(氯仿); EI-MSm/z440 [M]+;1H-NMR(CDCl3, 600 MHz) δ: 4.72(1H,br s,H-31b),4.67(1H,br s,H-31a), 3.29(1H, dd,J=11.4, 4.2 Hz, H-3), 1.04(6H,d,J=6.8 Hz, H-26, 27), 0.98(6H,s,H-18,29),0.91(3H, overlapped, H-28), 0.91(3H, overlapped, H-21), 0.82(3H, s, H-30), 0.56(1H,d,J=4.2 Hz, H-19b), 0.34(1H,d,J=4.2 Hz, H-19a);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ: 32.2(C-1), 30.6(C-2), 78.9(C-3), 40.7(C-4), 47.4(C-5), 21.4(C-6), 28.4(C-7), 48.2(C-8), 20.3(C-9), 26.3(C-10), 26.3(C-11), 35.8(C-12), 45.6(C-13), 49.1(C-14), 33.2(C-15), 26.7(C-16),52.5(C-17), 18.3(C-18), 30.1(C-19), 36.4(C-20), 18.6(C-21),35.3(C-22),31.6(C-23),157.1(C-24),34.1(C-25),22.1(C-26),22.3(C-27),19.6(C-28),25.7(C-29),14.3(C-30),106.2(C-31). 以上数据与Lee等[16]报道的二十四亚甲基环阿尔廷醇的数据基本一致, 故鉴定为二十四亚甲基环阿尔廷醇.

4 讨论

本文报道了从细叶石仙桃的乙酸乙酯部位分离得到6种单体化合物,且化合物I ～ V均为首次从该植物中分离得到,该研究结果丰富了细叶石仙桃的化学成分. 1,5-二羟基-2, 7-二甲氧基-9,10-二氢菲(Ⅰ)为9,10-二氢菲类,文献[2-3]也曾从细叶石仙桃中分离得到2种该类化合物,说明9,10-二氢菲类为细叶石仙桃特征性成分.同属植物云南石仙桃Pholidotayunnanensis[4]165和石仙桃Pholidotachinensis[5]2122中也曾分离得到1,5-二羟基-2,7-二甲氧基-9,10-二氢菲,表明亲缘关系越近的植物所含的化学成分越相似,故本研究结果也从化学分类学的角度提供了一定的证据．

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草 [M]. 第24卷. 上海： 上海科学技术出版社， 1999: 748.

[2] 李建晨, 冯丽, 野原稔弘. 细叶石仙桃的化学成分 [J]. 中国中药杂志, 2008, 33(14): 1691-1693.

[3] 李斌, 高洁莹, 李娟, 等. 细叶石仙桃乙酸乙酯部位化学成分研究 [J]. 中药材, 2014, 37(6): 987-989.

[4] GUO Xiaoyu, WANG Jue, WANG Naili, et al. 9,10-Dihydrophenanthrene derivatives fromPholidotayunnanensisand scavenging activity on DPPH free radical [J]. J Asian Nat Prod Res, 2007, 9(2): 165-174.

[5] YAO Sheng, TANG Chunping, LI Xiqiang, et al. Phochinenins A-F, dimeric 9,10-dihydrophenanthrene derivatives fromPholidotachinensis[J]. Helv Chim Acta, 2008, 91(11): 2122-2129.

[6] CHEN Yang, CAI Shining, DENG Liang, et al. Separation and purification of 9,10-dihydrophenanthrenes and bibenzyls fromPholidotachinensisby high-speed countercurrent chromatography [J]. J Sep Sci, 2015, 38(3): 453-459.

[7] 毕志明, 王峥涛, 徐珞珊, 等. 云南石仙桃中酚类成分的研究 [J]. 中国药学杂志, 2005, 40(4): 255-258.

[8] LEE C L, CHANG F R, YEN M H, et al. Cytotoxic phenanthrenequinones and 9,10-dihydrophenanthrenes fromCalanthearisanensis[J]. J Nat Prod, 2009, 72: 210-213.

[9] HWANG J S, LEE S A, HONG S S, et al. Phenanthrenes fromDendrobiumnobileand their inhibition of the LPS-induced production of nitric oxide in macrophage RAW 264.7 cells [J]. Bioorg Med Chem Lett, 2010, 20(12): 3785-3787.

[10] DATLA P, KALLURI M D, BASHA K, et al. 9,10-Dihydro-2,5-dimethoxyphenanthrene-1,7-diol, fromEulophiaochreata, inhibits inflammatory signalling mediated by Toll-like receptors [J]. British J Pharm, 2010, 160(5): 1158-1170.

[11] WANG Jue, WANG Liyan, KITANAKA S. Stilbene and dihydrophenanthrene derivatives fromPholidotachinensisand their nitric oxide inhibitory and radical-scavenging activities [J]. J Nat Med, 2007, 61(4): 381-386.

[12] 邵建华, 赵春超, 刘墨祥. 草玉梅抗肿瘤活性成分的分离与鉴定 [J]. 扬州大学学报(自然科学版), 2011, 14(2): 48-50.

[13] 孙希彩, 张春梦, 李金楠, 等. 紫花前胡的化学成分研究 [J]. 中草药, 2013, 44(15): 2044-2047.

[14] 杨素珍, 蒋建勤. 新疆芍药的化学成分研究 [J]. 中草药, 2014, 45(6): 760-764.

[15] 王国艳, 吴弢, 林平川, 等. 紫菀酚类化学成分的研究 [J]. 中国中药杂志, 2003, 10(28): 946-948.

[16] LEE S Y, CHOI S U, LEE J H, et al. A new phenylpropane glycoside from the rhizome ofSparganiumstoloniferum[J]. Arch Pharm Res, 2010, 33(4): 515-521.

(责任编辑 林 子)

The sparation and identification of the chemical constituents from ethyl acetate extract ofPholidotacantonensis

LIU Liang*, WANG Wei, YIN Qimeng, YAN Xin, HUANG Yixin,FAN Yiyun, FAN Yun, SHAO Mengnan, NI Chenhui, LIU Tao

(Sch of Med, Yangzhou Univ, Yangzhou 225009, China)

This paper studies the chemical constituents of ethyl acetate extract ofPholidotacantonensis. Compounds are seperated through silica gel, Sephadex LH-20 and ODS column chromatography and semi-HPLC, and their structures are identified by spectroscopic data and compared with those reported in the literature. The results show that six compounds are obtained from the ethyl acetate extract ofPholidotacantonensis. Their structures are elucidated as eulophiol (Ⅰ), bergapten (Ⅱ), osthole (Ⅲ), isovanillic acid (Ⅳ),E-ferulic acid hexacosyl ester (Ⅴ), 24-methylenecycloartanol (Ⅵ), respectively. Further more, Ⅰ～Ⅴ are reported from this plant for the first time.

Pholidotacantonensis; separation and purification; chemical constituent

2015-09-08. * 联系人, E-mail: enjoyyz@163.com.

江苏省高校自然科学基金资助项目(14KJB360005).

刘量, 王委, 殷启蒙, 等. 细叶石仙桃乙酸乙酯部位化学成分的分离与鉴定 [J]. 扬州大学学报(自然科学版), 2015, 18(4): 53-56.

R 284.1

A

1007-824X(2015)04-0053-04