聚酰胺-胺树枝状聚合物诱导牙体组织仿生矿化的研究现状

谢方方, 韦小浪

(广西医科大学附属口腔医院, 广西 南宁 530021)

·综述·

聚酰胺-胺树枝状聚合物诱导牙体组织仿生矿化的研究现状

谢方方, 韦小浪

(广西医科大学附属口腔医院, 广西 南宁 530021)

利用生物材料诱导牙体组织仿生矿化，从而实现牙体缺损的自愈性修复一直都是口腔医学研究的目标之一。聚酰胺-胺树枝状大分子(polyamidoamine dendrimer, PAMAM)作为一种新型高分子纳米材料，因其具有独特的性质而成为仿生矿化领域的研究热点。本文就PAMAM诱导牙体组织仿生矿化的理论背景及其研究现状作一综述。

聚酰胺-胺; 羟基磷灰石; 仿生矿化

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.011

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8):505]

牙体缺损(tooth defect)是指由各种原因引起的牙体硬组织外形及结构的异常和破坏。临床上修复常用的金属、复合树脂和陶瓷等材料，其结构性质与牙体组织相差较远，极有可能导致继发龋、牙本质过敏等并发症。因此，研究具有与牙体组织结构相似的生物材料，并以其诱导牙体硬组织缺损的自愈性修复，有重要的临床意义。

牙体组织的仿生矿化是一种模拟自然界中生物矿化的过程，即：以有机大分子(蛋白质或多糖)为模板，通过无机矿物离子和有机大分子在牙体组织界面处相互作用，从分子水平高度有序地组装成具有独特显微结构特点的矿化物的过程。具有三维结构的纳米级聚酰胺-胺(PAMAM)因其内部含有大量的酰胺基团，类似于蛋白质中的多肽键，且其分子大小与生物大分子相匹配，可设计成不同的结构和代数，并可模拟多种蛋白质的结构和功能，因而有“人工蛋白”的美誉[1]。PAMAM不仅具有明确可控的结构以利于深入探索生物矿化过程中蛋白质结构-功能关系;同时还具有高反应性、高溶解性及低毒性等特点。因此，学者们提出了将PAMAM作为能适用于牙体硬组织仿生矿化的有机大分子模板，并进行了相关研究。本文就PAMAM诱导牙体硬组织仿生矿化的理论背景及其研究现状作一综述。

1 PAMAM诱导牙体硬组织仿生矿化的理论背景

1.1 PAMAM的结构特点

PAMAM是Tomalia等[2](1985)通过反复加成反应首次合成的一类聚合物，即以乙二胺或氨为引发核，并由引发核向外逐步发生聚合反应，每循环1个反应就会在已形成的聚合物上增加1“层”或1“代”(layer或generation,G)，从而形成不同代数的树枝状聚合物，分别记作G0、G1、G2……以及G10等。每增加1个代数，聚合物的分子量均呈指数增长，聚合物表面的伯胺也呈双倍增加，而直径则增大约10Å[3-4]。PAMAM不仅具有三维结构、高度支化、分子内部存在空腔和表面基团易于改性等特点；同时还具有良好的生物相容性、低毒性和无免疫源性等优点，是目前研究最为广泛的一类树枝状聚合物[5]。低代数(0.5～3.5代)PAMAM为平面状的椭圆形，呈开放性结构，其内部的叔胺和酰胺基团可与金属离子结合；而高代数PAMAM则呈球状结构，其表面所覆盖的大量官能团可与金属离子结合[6]。不同代数或带有不同末端基团的PAMAM因具有不同的生物学特性，而使其诱导生物矿化的能力有所不同。

1.2 釉质仿生矿化的作用机制

釉质是由造釉细胞合成、分泌细胞外基质后进行生物矿化而形成的硬组织，主要由釉柱及其周围的釉柱间质组成。其中釉柱由羟基磷灰石晶体(HA)有序排列而成，而釉柱间质则含有有机物、水和极少量的矿化物。虽然釉质晶体定向排列的确切机制尚不清楚，但已证实釉原蛋白在促进HA的成核及调控的生长方向和速度上均发挥着重要作用[7]。因此，有学者认为：一方面，釉原蛋白自组装成“纳米球状”超分子结构，并进一步组装成双折射的显微带状结构，从而决定了HA的生长、取向和形态[8]；另一方面，造釉细胞分泌Ca2+、PO43+到矿化区内，随着釉质的形成，造釉细胞不断退离矿化区，使Ca2+、PO43+的沉积也表现出一定的方向性，从而参与并决定了釉质晶体的定向生长[9]。釉质微结构仿生的关键是复制其HA晶体的组装特点，基于釉质发育矿化原理及其矿化的分子机制，学者们认为釉质仿生矿化的关键是：构建“纳米微球”的超分子水凝胶基质，再辅以Ca2+、PO43+离子的定向输送使矿化能在凝胶基质中有序的进行。

1.3 牙本质仿生矿化的作用机制

牙本质与釉质类似，具有相同的基本结构模式，即HA沿着长轴生长并与胶原纤维平行，两者的主要区别在于牙本质的HA内有大量的有机胶原基质和蛋白嵌入。牙本质的再矿化包括2个连续过程：胶原网在前期牙本质中的形成，以及之后的再矿化前沿无机物的形成。目前，公认的观点是：牙本质的再矿化既不是自发性沉积也不是在有机基质(主要是I型胶原)上的成核，而是残留在矿化区的无机晶体的生长[10]。George A等[11]认为，在牙本质的生物矿化中，以胶原蛋白为矿物沉积模板，非胶原基质蛋白为成核剂或抑制剂诱导和调节牙本质的生物矿化。基于上述牙本质生物矿化的机制，有学者提出是否能以PAMAM作为牙本质再矿化的成核位点，并通过定向引入Ca、P等矿物离子，从而达到诱导牙本质仿生合成的目的。

2 PAMAM在牙体硬组织仿生矿化研究领域的应用

目前，关于牙体硬组织仿生再矿化的主导思路是：先形成有机物的自组装体，当牙体组织与自组装聚集体结合后，以自组装体为有机模板，并在溶液相的界面处发生化学反应，从而调控无机晶体的成核、生长、取向、形态和显微结构等[12]。本文从以下3个层次综述PAMAM在牙体组织仿生矿化方面的研究进展。

2.1 PAMAM与牙体组织表面的结合

Chen等[13](2003)用带有不同端基的PAMAM作为探针对大鼠釉质中HA表面的电荷分布进行研究时发现：带有羧基、氨基和乙酰氨基团的PAMAM均可通过电荷吸附或络合方式附着在釉质表面；AFM观察结果显示，PAMAM与晶体的结合力取决于PAMAM的末端基团，即两者的结合力大小顺序为带正电荷的氨基>带负电荷的羧基>中性的乙酰氨基，作者认为这种带正电荷的氨基所具有的较高结合力可能源于其电离作用较强或表面磷酸盐的浓度较高；该研究同时还发现，HA表面具有正电和负电交替分布的电荷带或不同的电荷阵列。尽管我们已经知道牙源性非胶原蛋白可结合到HA表面，但仍缺乏精确计算出其结合强度大小的相关研究。因此， Chen等[14](2004)又以羧基改性的G7.0 PAMAM作为纳米探针建立了HA表面与PAMAM结合能力的数学模型，并用AFM观察PAMAM在HA表面的分布特点，结果显示：PAMAM-COOH沿着晶体的c轴间隔分布，且两者的结合强度为90+/-20 KJ/mol。以上研究结果表明，PAMAM与HA晶体间的结合强度不仅依赖于PAMAM的末端基团，还取决于蛋白和晶体表面的电荷强度。

2.2 PAMAM对HA形成的影响

NaKa等[15]发现，PAMAM可模拟生物矿化制备球状碳酸钙晶体。据此学者们推测，PAMAM也可用于制备球状HA。Khopade等[16](2002)以半代端基为羧基的PAMAM作为模板，在模拟体液中用自沉淀法制备了球状HA，并推测：半代PAMAM起到成核位点的作用可能是由于其表面的羧基能结合Ca2+，或由于其两亲性而形成了超分子聚集体，也可能两者兼而有之。Zhou等[17]发现，端基分别为羧基和多羟基的PAMAM均可作为模板，并能在水热条件下调控HA的合成；同时还发现，PAMAM的内核具有亲水性并可作为Ca2+的络合位点，HA的结晶化可归因于成核位点的定位：PAMAM的内核或外表面。以上研究结果表明，PAMAM的末端基团、成核位点或结晶面的相对生长速率均可影响HA的形态和大小。

此外，Zhang等[18]报道，羧基改性的PAMAM(G5.5)似乎是晶体形成的抑制剂，并可在体外矿化的过程中影响HA的形态和粒径。受此研究的启发，Yan等[19]以表面基团为氨基的不同代数的PAMAM为模板， 用水热法合成HA，结果显示：HA的粒径随着PAMAM-NH3代数的增加而逐渐减小，当其代数从G1.0逐级增加到G4.0时，HA的粒径分别为82、77、48、38 nm，且其形状也从棒状变为椭球状；然而，当聚合物的代数增加到G5.0时，晶体的粒径并未发生改变；此外，当聚合物的浓度从5.0 gI-1增加到40 gI-1时，椭球状的HA粒径则从55 nm降到25 nm；同时还发现端基不同会造成PAMAM与Ca2+的络合点不同(即晶体成核点不同)，从而导致HA形成不同的形貌。

综上所述，可以推论：PAMAM可作为有机模板来调控HA的结晶过程。而不同端基和不同代数的PAMAM与金属离子的结合位点不同，即金属离子既可能结合在其表面的末端基团，也可能结合在其内部的含氮部位，从而导致不同的PAMAM吸附在生长中晶体的不同晶面上，并最终调控形成不同的晶体形貌。此外，高代数(G3.5以后)PAMAM对晶体的生长起抑制作用，可能与其开放结构能使其内部的含氮部分成为配位点，以及 PAMAM内部有限的结合能力有关。

2.3 PAMAM原位诱导牙体硬组织的仿生矿化

如上所述，PAMAM既可以与牙体组织结合，又可以调控HA的生长、成核和取向。因此，有学者提出，能否把PAMAM作为有机基质模板并原位诱导牙体组织再矿化，形成在结构和功能上高度仿生的牙体组织？Wu等[20](2012)根据生物矿化的有机机制理论，成功合成了可锚定到HA表面的ALN-PAMAM- COOH聚合物，并在脱矿的人类釉质表面(体外和体内)原位评估其生物矿化行为，结果显示：ALN与HA的特异性结合能使ALN- PAMAM- COOH聚合物吸附到釉质表面，并能在人工唾液中原位仿生合成HA，且新产生的平行束或纳米棒样HA 的大小和形状均较规则，与天然釉质的结构相似；动物实验也表明，低毒性的ALN- PAMAM- COOH聚合物能在大鼠的口腔环境中有效诱导HA的再矿化。然而，ALN- PAMAM- COOH聚合物的合成过程较复杂，一定程度上阻碍了其在生物医药领域方面的应用。因此， Chen等[21]又研究了PAMAM- COOH在钙磷溶液中对酸蚀釉质原位仿生合成的影响，其结果表明：PAMAM- COOH可作为脱矿釉质表面的有机模板，在相对较短的时间内诱导合成与天然釉质结构、取向和矿物相似的HA。

Chen等[22](2014)受釉质釉原蛋白结构和性质的启发，成功制备了PAMAM- PO3H2聚合物， 并模拟釉质再矿化过程中釉原蛋白的作用探讨了其在釉质原位仿生再矿化中的作用。结果显示，PAMAM-PO3H2与釉质间具有很强的结合力，且其在人工唾液中能诱导釉质新生成的HA结构高度有序并沿Z轴生长，即其结构与天然釉质的结构相似；同时还发现， PAMAM- PO3H2具有低细胞毒性，并可在大鼠口腔内诱导人类HA的生成；作者认为，PAMAM-PO3H2所具有的良好表现主要源于磷酸基团对钙离子的亲和力强于羧基，且对HA具有很强的结合力。综上所述，可以推论：经羧基和磷酸盐改性的PAMAM均具有釉原蛋白的潜能并可调控和诱导牙釉质的原位仿生再矿化。

脱矿牙本质由于其结构的特殊性，即主要由暴露的胶原纤维组成，而胶原纤维在生物矿化中主要起支架作用，自身并不能诱导成核。有研究报道[23]，在相同条件下，脱矿釉质的再矿化效果比脱矿牙本质的再矿化效果更佳，并认为脱矿牙本质的再矿化需要结合到胶原纤维上的模板来诱导的生长、成核。Li等[24]研究了G4 PAMAM- COOH在人工唾液中原位诱导脱矿牙本质的再矿化能力，并推测：PAMAM- COOH首先通过静电作用与暴露的胶原纤维紧密结合; 然后，PAMAM外表面带负电荷的-COOH基团及内部带负电荷的酰胺基团再通过静电作用与人工唾液中的钙离子结合，而钙离子又可继续吸引磷酸根离子，从而诱导HA的生长。李秋容等[25]报道，PAMAM联合Ca(OH)2液预处理更能有效的促进脱矿牙本质的再矿化，并认为：①饱和Ca(OH)2液的预处理可使大量Ca2+在牙本质表面聚集，从而保证了HA异相成核所需的局部过饱和状态，同时也降低了HA成核的能量阈值；②牙体组织表面结合的PAMAM- COOH呈酸性，通过Ca(OH)2液的预处理可使pH提高而有利于牙本质的再矿化。

众所周知， PAMAM的末端基团可以被改性成各种功能组，并可作为各种药物的运载体控制药物(如非甾体抗炎药)的释放。Zhou 等[26]报道，三氯生加载的G4-COOH溶液和G4-COOH聚合物均可诱导牙本质的再矿化，且在相同条件下高浓度组相对于低浓度组显示出更强的再矿化能力，主要归因于高浓度组可以维持较高的聚合物量在胶原原纤维间诱导再矿化；并提出：①三氯生加载的 G4-COOH的羧基末端通过静电作用结合到牙本质表面，此时，因G4-COOH的分子量(Mw=10 100 Da)在I型胶原蛋白(Mw=6～40 kDa)的保留范围内，加之胶原蛋白的凝胶排阻特性使其保留在牙本质胶原微纤维之间，从而使封装的三氯生将以一种受控的方式释放出来；②G4-COOH带负电的羧基末端可吸引并稳定人工唾液中无定形磷酸钙(ACP)；③矿化纤维以树枝状分子为模板使ACP以有序的方式形成HA。该研究结果提示，三氯生加载的G4-COOH聚合物既可作为载体来封装/释放抗菌药物，又可作为模板原位诱导牙本质的再矿化。

综上所述，PAMAM聚合物可吸附结合到牙体组织表面，并可调控HA的成核和生长，从而使PAMAM原位诱导釉质和牙本质的仿生矿化成为了口腔生物材料领域的研究热点。以PAMAM为模板研究牙体硬组织生物矿化的过程中，研究者们虽已发现了改性的PAMAM可诱导脱矿的牙体组织表面形成一层修复层并给出了一定的解释，但由于HA矿物晶体的成核和结晶过程非常复杂，有关 PAMAM聚合物的代数、表面基团、结构刚性、浓度及作用时间等对矿物晶体的影响机制未有明确而公认的解释。此外，PAMAM诱导牙体硬组织形成的再矿化修复层的物理和化学特性(显微硬度、抵抗酸刺激的能力及抵抗机械刺激的能力等)方面的研究也仅处于初期探索阶段。以上这些关键性问题的解决仍有待大量的研究工作来完成，相信PAMAM在牙科领域所展现出的诱人的发展前景定会吸引更多不同学科的学者联合起来，共同深入研究其在牙体硬组织仿生矿化方面的应用，并进一步制备出结构和性能理想的仿生材料。

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Polyamidoamine(PAMAM) dendrimer induces tooth organizations biomimetic mineralization: A review

XIE Fang- fang, WEI Xiao- lang

(DepartmentofStomatology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021 ,China)

Polyamidoamine (PAMAM) is a new type of polymer nano-materials. Because of its unique nature, it has been a hot topic in biomimetic mineralization research field. In this review, the structure and the mechanisms of PAMAM-induced biomimetic mineralization of tooth hard tissues are summarized.

polyamidoamine(PAMAM); hydroxyapatite(HA); biomimetic mineralization

2014-11-04

广西自然科学基金(2011GXNSFA01829)

谢方方(1974-)，男，汉族，广西南宁人。硕士，副教授

谢方方，E-mail: 759805241@qq.com

R783.1

A

1005-2593(2015)08-0505-05

广西高校科学技术研究一般项目(2013YB056)广西医疗卫生适宜技术研究开发项目(S201305-01)