β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌诱变选育及基因克隆表达

陈 计，高 鹏，陆兆新，吕凤霞，张 充，赵海珍，别小妹

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌诱变选育及基因克隆表达

陈 计，高 鹏，陆兆新，吕凤霞，张 充，赵海珍，别小妹*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

为获得β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌株，以高地芽孢杆菌YC-9为出发菌株，通过亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）和低能N+束诱变育种，筛选和选育得到两株突变株N-2-2 和10-30s-3，发酵培养60 h，酶 活力分别达到28.6 U/mL和36.1 U/mL ，分别是出发菌株的2.36 倍和2.98 倍，与YC-9菌株相比，突变菌株菌体生长下降但发酵产酶量增加。进一步将β-1,3-1,4-葡聚糖酶克隆并在大肠杆菌中成功表达，经过30 ℃诱导6 h后，胞内酶活力达79.2 U/mL，为出发菌株的6.5 倍。

高地芽孢杆菌；β-1,3-1,4-葡聚糖酶；亚硝基胍诱变；低能N+束注入；异源表达

β-1,3-1,4-葡聚糖酶（β-1,3-1,4-D-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶，E.C.3.2.1.73）分解β-1,3-1,4-葡聚糖中与β-D-1,3糖苷键相邻的β-D-1,4-糖苷键，降解产物主要是纤维三糖和纤维四糖，因其主要分解大麦中的β-1,3-1,4-葡聚糖和细菌地衣多糖，所以又称地衣多糖酶[1]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶，在啤酒酿造中，主要用于改善啤酒的混浊度，提高产品质量[2]，在饲料工业中，主要用作饲料添加剂，可有利于动物对营养物质的消化和吸收，提高生长性能和粮食的转化率[3]。迄今为止，β-1,3-1,4-葡聚糖酶已在芽孢杆菌、曲霉、毛霉、青霉和瘤胃微生物中得到广泛的发现[4-7]，然而大部分原始菌株的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力或者热稳定性较低，这就限制了其在工业上的应用。现阶段，提高酶表达量或者酶活的方法主要有：遗传育种、异源表达以及酶分子的定向和非定向改造。其中传统诱变育种因其成本低廉、方法简便、效果显著等优点，至今仍在生产实践中广泛应用[8-10]。而通过分子生物学手段，将外源酶基因导入宿主菌，构建异源表达系统，已成为当今科研界提高酶表达量的基本策略。

本课题组Mao Shurui等[11]在前期筛选和鉴定了产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高地芽孢杆菌YC-9，但原始菌株的酶表达量较低。本研究以高地芽孢杆菌YC-9为出发菌株，对其进行了诱变育种，并将β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中进行了异源表达。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基与试剂

高地芽孢杆菌YC-9（Bacillus altitudinis YC-9，保藏号CGMCC4314）、 Escherichia coli DH5α克隆宿主与Escherichia coli BL21（DE3） pLysS表达宿主为本实验室保藏。

营养琼脂（NA）培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2；LB培养基（液体）：酵母膏5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0；初筛培养基：酵母膏5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、地衣多糖1 g、刚果红0.4 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

克隆载体p M D 1 9-T载体、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、X-Gal、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 宝生物工程（大连）有限公司；表达载体pET-28a（+） 南京大学生命科学学院房云彬所赠；地衣多糖（lichenan） 爱尔兰Megazyme公司；X-Gal/IPTG Premix、dNTP、DNA标准分子质量Marker 南京金斯瑞公司；DNA凝胶回收试剂盒、柱式质粒提取试剂盒、琼脂糖、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨等 英国Oxoid公司；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；Centrifuge 5804R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Orion 3 STAR pH计 美国Orion公司；GXZ-9240 MBE恒温干燥箱、PYX-DHS-50X65隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂；JS-380C全自动数码凝胶成像分析仪 上海培清科技有限公司；PTC-100TMPCR热循环仪、PowerPacTMHC电泳仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性测定

采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[12]。酶活力单位定义为：在60 ℃、pH 7.0条件下每分钟从底物中释放1 μmol还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶活力单位（U）。计算公式如下：

式中：X为样品的酶活力/（U/mL）；n为稀释倍数；ρ为由回归方程计算出的葡萄糖的含量/（mg/mL）；10为反应时间，取10 min；M表示葡萄糖的分子质量/（g/mol）。

1.3.2 高地芽孢杆菌的亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）诱变

称取20 mg固体NTG溶于10 mL丙酮，使NTG溶液初始质量浓度为2 mg/mL。分别取NTG母液0.20、0.15、0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0 mL加入9 个4 mL离心管中，再吸取1 mL菌液加到各个离心管里，反应体系为2 mL，体积不够2 mL的用pH 6的缓冲液补足。37 ℃反应30 min后取100 μL稀释菌液涂布平板，37 ℃培养、挑单菌落、初筛、复筛。

1.3.3 高地芽孢杆菌的低能N+束注入诱变

本实验所用的离子束辐照设备由南京工业大学提供，采用低能N+注入，注入能量为10 keV和20 keV。将需离子注入的样品培养皿叠放在对照培养皿上方，一起放入离子注入机靶室，打开上方培养皿盖，靶室抽真空。在两个能量条件下，放置时间分别是0、30、60、90 s。随后吸取1 mL无菌水洗脱诱变后的菌膜成为1 mL菌液，取100 μL稀释菌液涂布平板，37 ℃培养、挑单菌落、初筛、复筛。

1.3.4 初筛和复筛

取100 μL稀释菌液涂布平板，37 ℃培养24 h，菌落计数。用灭菌的牙签挑取单菌落点种于初筛平板上，37 ℃培养24 h。用游标卡尺量取菌落周围的水解圈，挑取水解圈大的菌株作为复筛菌株，并分别按公式（2）、（3）计算致死率、突变率[13]。

式中：N为对照组单菌落数/（CFU/mL）；N′为诱变处理样品单菌落数/（CFU/mL）；N”为突变菌落数/（CFU/mL）。

将经初筛得到的菌株于50 mL LB液体培养基中37 ℃条件下180 r/min摇床培养6 h左右，至OD600nm值为0.6～0.8，制备种子液；再按2%接种量将种子液接种至发酵培养基，于37 ℃条件下180 r/min摇床培养60 h。发酵培养液于5 000×g离心15 min，取上清液测酶活力。

1.3.5 遗传稳定性实验

将诱变筛选出的高产菌株进行传代培养，每隔24 h传代1 次，共传6 代，然后将每一代菌株分别进行摇瓶发酵，根据酶活大小检测菌株的传代稳定性。

1.3.6 诱变菌株与原始菌株的生长产酶情况比较

将经NTG诱变和低能N+束诱变得到的菌株N-2-2和10-30s-3，以及原始菌种高地芽孢杆菌YC-9分别接种于100 mL LB液体培养基，于37 ℃条件下180 r/min摇床培养6 h左右至OD600nm值为0.6～0.8，制备种子液；再按2%接种量将种子液接种至发酵培养基，于37 ℃条件下180 r/min摇床培养60 h，每隔6 h取样3 mL，于紫外-可见分光光度计600 nm波长处测菌体浓度，同时将所取样品于5 000×g离心15 min，取上清液测酶活力，比较诱变后得到的菌株与原始菌株的生长产酶情况差异。

1.3.7 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的扩增

根据GenBank登录的高地芽孢杆菌YC-9 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因序列，用引物设计软件Primer premier 5及DNAMAN等生物软件，设计β-1,3-1,4-葡聚糖酶扩增引物：上游引物bgl-F：5′-CGGATCCATGTCTTACCGTGT GAAACGAATG-3′，下游引物bgl-R：5′-CCGCTCGAG TTATCTTTTTGTGTAACGTACC-3′，下划线分别为酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，酶切位点前为保护碱基。以高地芽孢杆菌YC-9基因组为模板，以bgl-F、bgl-R为引物，扩增β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；30 个循环；72 ℃延伸10 min；PCR产物经过1.0%琼脂糖回收预期大小的片段，与pMD19-T载体连接，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素LB平板上，挑选阳性克隆，提质粒进行测序验证，得重组克隆载体pMD19-T-bgl。

1.3.8 重组表达载体的构建

将获得的pMD19-T-bgl用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收目的片段，并与同样经过BamHⅠ和XhoⅠ双切的载体pET-28a（+）进行16 ℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB平板，37 ℃过夜培养后。挑选阳性克隆子提取质粒进行测序，并用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切验证。

1.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）电泳检测β-1,3-1,4-葡聚糖酶在E. coli BL21中的表达

将β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因重组菌株E. coli BL21（pET-28a-bgl）和参照菌株E. coli BL21（pET-28a（+）），分别接种一环到加有50 μg/mL Kan的液体LB培养基中，置于37 ℃条件下180 r/min摇床培养过夜；然后按2%的接种量转接到100 mL含有相同量Kan的新鲜液体LB培养基中，37 ℃、180 r/min摇床培养至菌体质量浓度0.6～0.8 μg/mL，然后加入IPTG至终质量浓度为100 μg/mL，37 ℃、180 r/min诱导培养6 h，离心弃上清，用细胞破碎液悬浮细胞，置于细胞破碎仪下破碎，破碎完，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳。采用质量分数12%分离胶，质量分数5%浓缩胶的SDS-PAGE，样品加入5×上样缓冲液，沸水浴5 min后，上样15 μL进行电泳。BL21菌株除了不加抗生素外，其他操作与重组菌株和参照菌株一致。

1.3.10 不同温度下工程菌诱导产酶情况

将β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因重组菌株E. coli BL21（pET-28a-bgl）接种一环到加有50 μg/mL Kan的液体LB培养基中，置于37 ℃、180 r/min摇床培养过夜；然后按2%的接种量转接到100 mL含有相同量Kan的新鲜液体LB培养基中，37 ℃、180 r/min摇床培养至菌体OD600nm值为0.6～0.8，然后加入IPTG至终质量浓度为100 μg/mL，分别于37、30、16 ℃条件下诱导培养6 h。离心弃上清，用细胞破碎液悬浮细胞，置于细胞破碎仪下破碎，破碎完，离心取上清液，测酶活力。

2 结果与分析

2.1 NTG诱变后的致死率、正负突变率及复筛结果

图1 NTG诱变后的致死率和正负突变率Fig.1 Mortality, positive and negative mutation rates after NTG mutagenesis

由图1可知，随着NTG质量浓度的升高，致死率不断提高，正突变率整体呈现先上升后下降的趋势，并在NTG质量浓度为0.08 mg/mL时最大，因此确定该质量浓度为后续NTG诱变时的最佳处理条件。经过两轮诱变筛选，获得一株产β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活性较原始菌株有较大提高的菌株，并命名为N-2-2，酶活力为（28.6±1.2）U/mL，较原始菌株酶活力（（12.1±1.3）U/mL）提高136%。

2.2 低能N+束注入诱变后的致死率及复筛结果

图2 N 2 N+束注入诱变处理结果Fig.2 Mortality after N+beam implantation

由图2可知，在注入能量为20 keV条件下，注入30 s时，致死率已高达80%以上，说明该能量条件下，注入较短时间，已产生较大的致死效应，因此不适合本实验菌株的诱变；当注入能量为10 keV时，在注入时间分别为30、60、90 s时，致死率分别为10.1%、21.5%、74.7%，随着注入时间的延长，致死率不断增加，可以看出此注入能量适合本实验菌株的诱变。本次N+注入诱变的出发菌株为NTG诱变后获得的菌株N-2-2，经过一轮N+注入诱变，在注入能量为10 keV，注入时间为30 s条件下，筛选出一株产β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力较出发菌株N-2-2提高26.2%的菌株，命名为10-30s-3，该菌株酶活力达（36.1±2.5）U/mL，是原始菌株的2.98 倍。

2.3 遗传稳定性实验

图3 突变株遗传稳定性Fig.3 Genetic stability of the two mutants and the original strain

由图3可知，摇瓶发酵时，诱变菌株N-2-2、10-30s-3的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力一直高于原始菌株，在传6 代时，酶活力都维持在相对稳定的范围，能够较稳定遗传，说明诱变提高了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的产量。

2.4 诱变菌株与原始菌株的生长产酶情况比较

图4 菌株N-2-2、10-30s-3及原始菌株生长情况比较Fig.4 Comparison of the growth characteristics of the mutant strains and the parent strain

图5 菌株N-2-2、10-30s-3及原始菌株产酶情况比较Fig.5 Comparison of the enzyme production of the mutant strains and the parent strain

由图4可知，3 株菌株的生长情况大致可分为以下3 个阶段，在0～12 h处于对数生长期，在12～48 h处于相对稳定期，在48～72 h处于明显衰亡期。在对数期，诱变菌株N-2-2和10-30s-3的生长速率明显高于原始菌株YC-9；在稳定期，3 株菌株活菌数均在下降，但诱变菌株N-2-2和10-30s-3的下降趋势较原始菌株YC-9要更明显；在培养24 h后，诱变菌株N-2-2和10-30s-3的活菌数始终低于原始菌株YC-9。由图5可知，诱变菌株和原始菌株的产酶特征较一致，均随着时间的延长，酶活力不断增加，并且大致都在发酵60 h左右，酶活力达到最大值；但每一取样点，诱变菌株的酶活力都高于原始菌株；综上，突变菌株与原始菌株在生长和产酶上有着较大的差异，即突变菌株生长速率高于原始菌株，且下降趋势更快，除此之外，突变菌株在生长不断下降的时候，酶活力上升趋势却快于原始菌株。

2.5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的扩增

图6 6 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的扩增Fig.6 Amplifi cation of β-1,3-1,4-glucanase gene

利用引物bgl-F/bgl-R扩增得到的阳性条带大小在750 bp左右，如图6所示，与目的基因β-1,3-1,4-葡聚糖酶的大小（732 bp，编码243 个氨基酸）基本相符，测序验证，成功扩增出β-葡聚糖酶基因。

2.6 重组表达载体的构建

图7 重组质粒pET28a（+）-bgl的双酶切鉴定Fig.7 Identifi cation of recombinant plasmid pET28a-bgl digested with BamHⅠ and XhoⅠ

将双酶切及测序验证正确的pMD19-T-bgl和载体pET-28a（+）分别经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收相应片段，连接产物转化大肠杆菌BL21，挑取转化子扩增并抽提质粒。将抽提的质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，得到了750 bp左右和5 000～6 000 bp左右的条带（图7），证实β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因成功插入载体pET-28a（+），将重组质粒命名为pET-28a-bgl。

2.7 SDS-PAGE电泳检测β-1,3-1,4-葡聚糖酶在E. coli BL21中的表达

图8 SDS-PAGE电泳检测-1,3-1,4-葡聚糖酶在重组E. coli BL21中的表达Fig.8 SDS-PAGE analysis of β-1,3-1,4-glucanase expression in recombinant E. coli BL21

由图8可知，工程菌E. coli BL21（pET-28a-bgl）中有一条较深的与27 kD的理论分子质量相近的蛋白条带（箭头所示），而E. coli BL21和E. coli BL21（pET-28a（+））中未见相应的条带，该结果表明β-1,3-1,4-葡聚糖酶重组载体pET-28a-bgl在E. coli BL21中成功实现了表达。Mao Shurui等[11]用pET-32a（+）也实现了该酶在大肠杆菌中的高效表达，由于pET-32a（+）带有18 kD的融合表达标签（Trx·Tag/His·Tag/S·Tag），使得表达后的酶蛋白以大小45 kD左右的形式出现。而本研究所用表达载体为pET-28a（+），由于不含Trx·Tag/S·Tag等标签，使得所表达的重组蛋白以更接近原始蛋白大小的形式出现。

2.8 不同温度下工程菌E. coli BL21（pET-28a-bgl）诱导产酶情况

图9 不同温度下工程菌E. coli BL21（pET-28a-bgl）诱导产酶比较Fig.9 Induced production of the enzyme in E. coli BL21 (pET-28a-bgl) at different temperatures

由图9可知，30 ℃更适合工程菌E. coli BL21（pET-28a-bgl）的诱导产酶，且在诱导6 h后，酶活力达79.2 U/mL，是原始菌株的6.5 倍。

3 讨 论

目前，国内外对β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌株的诱变选育还鲜有报道。本研究利用NTG处理原始菌株，获得了一株β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌株，酶活力为原始菌株的2.36 倍，结果表明，利用单一诱变剂或诱变方式对出发菌株进行诱变处理，即可获得高产突变株。通常菌株在经过同一诱变剂的多轮处理后会对其产生耐受性，因而若想进一步提高突变株产量，需选择其他诱变剂或诱变方式，在这方面国内外已经取得了良好的结果[14-15]。因此，本研究在NTG诱变处理的基础上，再用N+束处理获得的突变株，但是效果并不理想，所筛选出的一株酶活力提高最高的突变株，较出发菌株相比，也只提高了26.2%，结果表明，有些情况下，多种诱变剂或诱变方式依次或者复合对菌株进行处理，并不一定能够得到高产菌株，有时甚至会产生较高的负效应[16]。所有这些都提示诱变育种是一项复杂的科研工作，存在一定的偶然性。进一步实验发现，突变菌株的生长特点和产酶性能与原始菌株有较大的差异，这种诱变后出现的生长代谢差异在其他报道中也有提及，例如，万涛等[17]利用激光诱变石油脱硫菌 cordonia sp. WQ-01后获得的突变株，延滞期较短，对数期菌体生长更快﹑降解二苯并噻吩（dibenzothiophene，DBT）的速率更高，但对于这些改变的深层次原因尚不清楚，因此有待于进一步的研究。而与传统的诱变育种相比，利用基因工程手段，异源表达酶基因，周期更短，效果更明显[18-20]，更不具有菌株退化甚至回复突变的可能，已成为提高目标物产量的首选。因此，本研究在对原始菌株进行诱变后，又利用基因工程技术，将来自高地芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因成功地在大肠杆菌中进行了克隆表达，经诱导，胞内酶活力为原始菌株的6.5 倍，和传统的诱变育种相比，酶活性提高幅度更大。本研究不仅获得了β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活有较大提高的突变株，还获得了高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的重组大肠杆菌，这些都为热稳定性β-1,3-1,4-葡聚糖酶的进一步研究和工业化应用打下了坚实的基础。

[1] HRMOVA M, BANIK M, HARVEY A J, et al. Polysaccharide hydrolases in germinated barley and their role in the depolymerization of plant and fungal cell walls[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 1997, 21(1): 67-72.

[2] 毕静. β-葡聚糖酶在啤酒生产中的应用研究[J]. 中国酿造, 2011, 30(9): 105-106.

[3] OFFICER D L. Effect of multi-enzyme supplements on the growth performance of piglets during the pre-and post-weaning periods[J]. Animal Feed Science and Technology, 1995, 56(1): 55-65.

[4] SAIT M E, SHELLA I M, HARRY J H. Isolation and over expression of a gene encoding an extracellular β-glucanase from Streptococcusbovis JBI[J]. Applied And Environmental Microboilogy, 1997, 63(10): 3752-3756.

[5] FLINT H J, MEPHERSON E C, BISSET J. Molecular cloning of genes from ruminococcus fl avefaciens encoding xylanase and β-1,3-1,4-glucanase activities[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55(5): 1230-1233.

[6] YANG Shaoqing, QIAO Juanyan, JIANG Zhengqiang, et al. Biochemical characterization of a novel thermostable β-glucanase (lichenase) from Paecilomyces thermophila[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(13): 5345-5351.

[7] JUNG Y J, YOO J S, LEE Y S, et al. Purifi cation and characterization of thermostable β-1,3-1,4-glucanase from Bacillus sp. A8-8[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2007, 12(3): 265-270.

[8] 王璋, 王灼维, 莫湘筠, 等. 微生物转谷氨酰胺酶的生产菌种诱变和发酵生产分析[J]. 生物加工过程, 2003, 1(1): 52-59.

[9] 赵彩艳, 李庚飞, 尤跃钧, 等. 氮离子注入选育β-葡聚糖酶高产菌株的研究[J]. 饲料研究, 2008, 4(3): 44-47.

[10] WANG Haiyan, LIU Daimei, LIU Yan, et al. Screening and mutagenesis of a novel Bacillus pumilus strain producing alkaline protease for dehairing[J]. Letters in Applied Microbiology, 2007, 44(1): 1-6.

[11] MAO Shurui, LU Zhaoxin, ZHANG Chong, et al. Purification, characterization, and heterologous expression of a thermostable β-1,3-1,4-glucanase from Bacillus altitudinis YC-9[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 169(3): 960-975.

[12] EDNEY M J, MARCHYLOB A, MACGREGOR A W. Structure of total barley β-glucan[J]. Journal of the Institute of Brewing, 1991, 97(1): 39-44.

[13] 方传记, 陆兆新, 孙力军, 等. 低能N+离子注入选育抗菌脂肽高产菌及其发酵的研究[J]. 辐射研究与辐射工艺学报, 2004, 24(6): 333-336.

[14] FANG X, YANO S, INOUE H, et al. Strain improvement of Acremonium cellulolyticus for cellulase production by mutation[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 107(3): 256-261.

[15] 郭芳芳, 李金良, 陆兆新, 等. 复合诱变选育表面活性素(surfactin)高产菌株[J]. 食品科学, 2011, 32(23): 270-276.

[16] 王连峰, 陈恒雷, 张军, 等. 阿魏菇多糖高产菌株筛选的离子束诱变和复合诱变对比研究[J]. 辐射研究与辐射工艺学报, 2009, 27(4): 248-252.

[17] 万涛, 黄笛, 闻建平, 等. 石油脱硫菌Gordonia sp. WQ-01激光诱变选育及关键酶DszC克隆表达分析[J]. 化学工业与工程, 2013, 30(6): 67-73.

[18] TENG Da, WANG Jianhua, FAN Ying, et al. Cloning of β-1,3-1,4-glucanase gene from Bacillus licheniformis EGW039 (CGMCC 0635) and its expression in Escherichia coli BL21 (DE3)[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 72(4): 705-712.

[19] HUANG Huoqing, YANG Peilong, LUO Huiying, et al. High-level expression of a truncated 1,3-1,4-β-D-glucanase from Fibrobacter succinogenes in Pichia pastoris by optimization of codons and fermentation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 78(1): 95-103.

[20] 李永仙, 谢淼, 朱林江, 等. 淀粉液化芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆与表达[J]. 生物工程学报, 2009, 25(4): 542-548.

Breeding of High-Yield β-1,3-1,4-Glucanase-Producing Strain by Mutagenesis, and Cloning and Expression of β-1,3-1,4-Glucanase Gene

CHEN Ji, GAO Peng, LU Zhaoxin, LÜ Fengxia, ZHANG Chong, ZHAO Haizhen, BIE Xiaomei*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to obtain a high-yield β-1,3-1,4-glucanase producing strain, Bacillus altitudinis YC-9 was used as the starting strain and mutagenized sequentially with nitrosoguanidine (NTG) and N+beam. The preliminary and secondary screening results showed that strain N-2-2 and 10-30s-3 had high ability to produce β-1,3-1,4-glucanase, with a yield of 28.6 and 36.1 U/mL, which revealed a 2.36- and 2.98-fold increase compared with that of the original strain, respectively, while exhibiting reduced growth rates. Furthermore, the β-1,3-1,4-glucanase gene was successfully cloned and expressed in E. coli. The intracellular activity was 79.2 U/mL, a 6.5-fold increase compared with the original strain, when induced at 30 ℃ for 6 h.

Bacillus altitudinis; β-1,3-1,4-glucanase; nitrosoguanidine (NTG) mutagenesis; N+beam implantation; heterologous expression

TS201.3

A

1002-6630（2015）01-0179-06

10.7506/spkx1002-6630-201501034

2014-03-14

陈计（1988—），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：2011108007@njau.edu.cn

*通信作者：别小妹（1964—），女，教授，博士，研究方向为食品微生物及生物技术。E-mail：bxm43@njau.edu.cn