一种查尔酮衍生物对H 1 792细胞增殖及凋亡的影响

李大鹏　卢冠男　张磊　赵东海

一种查尔酮衍生物对H 1 792细胞增殖及凋亡的影响

李大鹏1卢冠男1张磊2赵东海3

目的 探讨查尔酮衍生物（4’-甲基-2，4-二羟基查尔酮）对体外培养的肺癌细胞H 1 792增殖的影响。方法 体外培养H 1 792细胞，以不同浓度（10、20及40 μmol/L）的4’-甲基-2，4-二羟基查尔酮处理细胞，作用不同时间。经瑞氏染色进行细胞形态学观察，以MTT法检测细胞存活率，并以流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 与对照组相比，各剂量组的4’-甲基-2，4-羟基查尔酮均能有效抑制H 1 792肺癌细胞的增殖，P＜0.05，差异具有统计学意义，且呈现出时间浓度依赖性；用药后，细胞形态出现凋亡特征，且随药物浓度增加，细胞凋亡率增加，P＜0.05，差异具有统计学意义。结论 此查尔酮衍生物能有效抑制H 1 792肺癌细胞的增殖，其作用机制可能与细胞凋亡有关，为临床非小细胞肺癌细胞的治疗提供了研究基础。

查尔酮；衍生物；H 1 792细胞；增殖；凋亡

1　材料与方法

1.1材料

使用材料为4’-甲基-2，4-羟基查尔酮（浙江海洋学院食品与医药学院），四唑氮蓝MTT（Sigma公司），RPMI 1 640培养基（Gibco公司），小牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），H 1 792肺癌细胞株（中科院上海生命科学研究院细胞资源中心），二甲基亚砜（Gibco公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养 H 1 792细胞培养于含10%小牛血清血清、100 IU青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1 640培养液中，37℃、5% CO2条件下于饱和湿度培养箱中培养。细胞呈贴壁生长，常规传代。选对数生长期细胞进行试验。

1.2.2细胞生长状态观察 应用不同剂量（10，20及40 μmol/L）的4’-甲基-2，4-羟基查尔酮细胞为用药组，相同条件但不加药物的培养细胞为对照组。将细胞悬液（1×104/ml）接种于96孔板，100 μl/孔，每一浓度设5个复孔，同时设对照孔，分别培养12 h、24 h和48 h时于倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.3瑞氏染色观察 取对数生长期细胞于细胞培养瓶中进行培养，药物处理同上，培养24 h后，0.25%胰酶消化，800 r/min离心5 min，弃上清液，将细胞沉淀均匀涂于载玻片上，丙酮固定10 min，PBS冲洗并晾干，滴加适量瑞氏染液，静置1 min，加等量PBS混匀，5 min后水洗、吸干，进行镜检观察。

1.2.4细胞增殖的检测 取对数生长期的H 1 792细胞，0.25%胰酶消化后制成细胞悬液（1×104/ml），接种于96孔板中，加入不同剂量的4’-甲基-2，4-羟基查尔酮（10、20及40 μmol/L），以含等体积DMSO的RPMI 1 640培养基作空白对照，每组设5个复孔，分别培养12 h、24 h和48 h后加入20 μL MTT，继续培养4 h后加入DMSO轻微震荡10 min，酶联免疫检测仪于490 nm进行检测，每孔重复测定3次并取平均值，记录A 490值，并求细胞生长抑制率（IR）＝（1-给药孔平均A值/对照孔平均A值）×100%。

1.2.5细胞凋亡的检测 以10、20、40 μmol/L的4’-甲基-2，4-羟基查尔酮作用于H 1 792细胞6后，800 r/min离心5 min，细胞以预冷PBS重悬，800 r/min离心5 min，弃上清液，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC结合液悬浮细胞并加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC混匀，室温避光孵育15 min；800 r/min离心5 min；弃上清液，加190 μL的Annexin Ⅴ-FITC结合液，悬浮细胞，测定前5 min再加入5 μL PI染色；重复试验3次，结果以凋亡细胞百分率表示。

1.3统计学方法

所得数据采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析，计量资料用（±s）表示，采用t检验，P＜0.05，差异具有统计学意义。

2　结果与分析

2.1细胞生长状态观察

倒置显微镜观察以不同剂量4’-甲基-2，4-羟基查尔酮处理的细胞。结果显示，与对照组相比，给药组细胞形态均出现异常，其细胞体积变小，细胞间隙变大，胞浆中出现颗粒，有部分细胞由贴壁转为悬浮状态。高浓度药物处理后部分细胞已经死亡。

2.2瑞氏染色结果

细胞经瑞氏染色后，对照组细胞核质比大，细胞核近圆形或椭圆形。而给药组细胞出现以下变化：细胞变小且变圆，核质比变小，细胞边缘模糊，细胞核出现碎片，胞质浓染。说明细胞用药后出现退行性改变，呈老化状态。

2.3细胞增殖的检测

不同剂量的4’-甲基-2，4-羟基查尔酮（10、20及40 μmol/L）作用于细胞24 h后进行MTT检测，与对照组相比，各浓度4’-甲基-2，4-二羟基查尔酮对H 1 792细胞的增殖均有抑制作用，P＜0.05，差异具有统计学意义。并呈现剂量依赖性；且随药物作用时间延长，增殖抑制作用加强，呈时效依赖性，见表1。

表1　实验组不同药物浓度对H 1 792细胞增殖的影响（±s）

表1　实验组不同药物浓度对H 1 792细胞增殖的影响（±s）

4’-甲基-2，4-羟基 　　　　　　　 生长抑制率（%）查尔酮浓度μ mol/L 　12 h 　24 h 　48 h 10 　6.33±0.86　　11.15±0.78 22.54±0.81 20 　12.34±0.75 　15.01±0.92 25.23±0.78 40 　43.11±1.45 　54.23±1.79 76.05±1.48

2.4细胞凋亡的检测

不同浓度4’-甲基-2，4-羟基查尔酮作用于H 1 792细胞后，以流式细胞仪检测细胞凋亡细胞百分率。结果显示：药物浓度为0、10、20及40 μmol/L时，H 1 792细胞的凋亡率分别为（0.86±0.21）%、（12.69±1.36）%、（29.43±3.56）%、（35.73±2.61）%。随药物浓度增高，H 1 792细胞凋亡率增高，呈剂量依赖性，P＜0.05，差异具有统计学意义。

3　讨论

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，近年来，随着吸烟人数的增加和大气污染的加重，肺癌现已居于我国城市人口恶性肿瘤的死亡原因第一位，且其发病率仍呈现持续上升的趋势。非小细胞型肺癌包括大细胞癌、腺癌和鳞癌，与小细胞癌不同的是，其癌细胞生长分裂缓慢，扩散转移也相对较晚。非小细胞肺癌约占肺癌的80%，其中约75%患者发现时已处于癌症中晚期，其5年生存率很低[5]，故开发新的抗肺癌药物具有重要临床意义。肿瘤细胞具有过度增殖的共性，抑制肿瘤细胞生长增殖是抗肿瘤药研究的重要靶点。黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一类药用化合物，在植物中常与糖结合成苷类。绝大多数植物都含黄酮类化合物，其在植物生长发育、开花结果及抗菌防病方面具有重要作用。查尔酮黄酮化合物的重要组成部分，是植物合成黄酮的前体物质，流行病学研究及肿瘤细胞学相关研究表明，查尔酮及其衍生物具有很好的抗肿瘤作用，其作用机制可能涉及肿瘤发生的多个环节[6]，例如抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡。本研究采用瑞士染色的方法观察4’-甲基-2，4-二羟基查尔酮作用于肺癌细胞H 1 792细胞的细胞形态变化，以MTT法检测药物组对H 1 792细胞增殖的影响，并以流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示，药物处理组细胞形态出现退行性改变并表现出凋亡细胞的特征。MTT结果显示4’-甲基-2，4-二羟基查尔酮对H 1 792细胞增殖具有抑制作用。流式细胞术结果表明药物组细胞凋亡率增加。本次研究结果显示4’-甲基-2，4-二羟基查尔酮能够抑制H 1 792细胞增殖，可能机制为诱导细胞凋亡。此研究结果为4’-甲基-2，4-二羟基查尔酮作为肺癌治疗新药的前期研究提供了依据。

[1]赵乐晶，石玉，刘巍，等. 新型查尔酮类化合物的合成及其抗肿瘤活性[J]. 中国药物化学杂志，2010，20（3）：161-165.

[2]Qiu J, Feng H, Xiang H. Influence of subinhibitory concentrations of licochalcone A on the secretion of enterotoxins A and B by staphylococcus aureus[J]. FEMS Microbiol Lett, 2010，307（2）：135-141.

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[4]Xiao XY, Hao M, Yang XY. Licochalcone A inhibits growth of gastric cancer cells by arresting cell cycle progression and inducing apoptosis[J]. Elsevier, 2011，302（1）：69-75.

[5]王颖轶，陈书长． STATS，VEGF和EGFR在非小细胞肺癌中表达的相关研究[J]．现代肿瘤医学，2014，22（4）：826-829．

[6]Shibata S. A drug over the millennia ：pharmacognosy, chemistry and pharmacology of licorice[J]. Yakugaku Zasshi, 2000，120（10）：849-862.

The Influence of a Sort of Ramification Chalcone for H 1 792 Cell Proliferation and Apoptosis

LI Dapeng1LU Guannan1ZHANG Lei2ZHAO Donghai31 Department of Respiratory Medicine, the Affiliated Hospital of Jilin Medical College, Jilin 132013, China. 2 Laboratory Medical College, Jilin Medical College, Jilin 132013, China. 3 Department of Pathology, Jilin Medical College, Jilin 132013, China

Objective To investigate antiproliferative effects of derivatived ochalcone 4’-methyl-2,4 Hydroxy chalcone in H 1 792 lung cancer cells. Methods Incultured H 1 792 lung cancer cells in virto , Treated cell with 4’-methyl-2,4 Hydroxy chalcone of 10~20 and 40 μmol/L. The MTT test and swiss dyeing were performed to detect the inhibitory effect of H 1 792 cells proliferation. Results Compared with control group, the antiproliferation of H 1 792 cells in different doses of 4’-methyl-2,4 Hydroxy chalcone groups were increased, P＜0.05, was difference had statisticaly significance, and presented time concentration dependence. After treatment, the cell morphology was characterized by apoptosis, and the apoptosis rate was increased, P＜0.05, was difference had statistically significance, with the increase of drug concentration. Conclusion The derivatived ochalcone can inhibit the growth of H 1 792 lung cancer cells, and its mechanism may by related to apoptosis. These results provide a research foundation for clinical treatment of non small cell lung cancer cells.

Chalcone, Derivant, H 1 792 cells, Proliferation, Apoptosis

R33

A

1674-9308（2015）31-0029-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.31.020

1 132013吉林医药学院附属医院呼吸内科；2 132013吉林医药学院检验学院；3 132013吉林医药学院基础医学院

查尔酮类化合物为广泛存在于天然药用植物（如红花、甘草等）中的一类黄酮类化合物，其分子式为C15H12O，中文名称为1，3-二苯基-2-丙烯-1-酮或2-苯亚甲基苯乙酮。查尔酮及其衍生物可在实验室环境下由苯甲醛和苯乙酮在碱性条件下缩合生成，且为黄酮化学合成的重要中间体[1]。查尔酮及其衍生物中含有的α，β-烯酮结构使其分子具有较大柔性，可与不同受体结合发挥多种生物活性，如抗肿瘤、降血脂、抗氧化、抗溃疡、抗疟疾、抗菌消炎等[2]。目前，对于查尔酮类化合物的抗肿瘤活性开展了大量的相关研究[3-4]。4’-甲基-2，4-羟基查尔酮是一种新型的查尔酮衍生化合物，前期实验研究表明其具有抗肿瘤的作用，但目前有关其对H 1 792小细胞肺癌细胞的作用尚未见研究报道。本实验选用H 1 792肺癌细胞株，观察4’-甲基-2，4-羟基查尔酮对H 1 792细胞增殖的影响，为4’-甲基-2，4-羟基查尔酮在抗肺部肿瘤的临床研究提供实验参考。