雪松枝叶挥发性物质的化感作用及其化学成分分析
2015-12-06李晓凤焦慧袁艺田胜尼
李晓凤，焦慧，袁艺，田胜尼
安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036
雪松枝叶挥发性物质的化感作用及其化学成分分析
李晓凤，焦慧，袁艺，田胜尼*
安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036
采用半密闭容器测定法，研究了离体雪松（Cedrus deodara）枝叶挥发性物质对白菜（Brassica pekinensis）、萝卜(Raphanus sativus)、莴苣（Lactuca sativa）种子萌发的化感作用，并对其成分进行了GC-MS分析。结果表明：雪松枝叶的自然挥发物对白菜、萝卜和莴苣的发芽率和干质量影响不显著，但对萌发的芽长产生显著的影响，而挥发油对受体种子的发芽率、发芽指数、萌发的根长以及芽长均产生显著的抑制作用，其中对莴苣的发芽率和发芽指数的抑制效应达到92.85%和96.43%，对白菜种子萌发的根长的抑制效应达到51.3%，表明雪松枝叶的挥发物中存在潜在的化感物质，抑制种子的萌发，且挥发油的化感作用大于自然挥发物。对挥发油和自然挥发性成分分析结果表明，两种方法收集的挥发性气体中均鉴定出大量的萜烯类化合物，其中挥发油中鉴定出37种化合物，84.68%为萜烯类化合物，主要成分为α-蒎烯（24.72%）、β-蒎烯（21.04%）、1-石竹烯（12.42%）；自然挥发物中鉴定出22种化合物，52.81%也都是萜烯类化合物，主要成分为α-蒎烯（17.16%）、β-蒎烯（11.53%）、b-侧柏烯（13.06%），两者共有成分15种，均为萜烯类化合物，其中挥发油中的成分含量较高，挥发油中化学成分的种类以及成分含量均大于自然挥发物，这可能是导致挥发油的化感作用大于自然挥发物的一个原因。从成分的分析结果可以看出，萜烯类化合物是雪松挥发性物质的主要成分，因此雪松枝叶挥发物的化感作用可能与其中的萜烯类物质有关。
雪松；挥发油；发芽率；发芽指数；萜烯类化合物
植物的化感作用主要指通过挥发、淋溶、根系分泌和残体腐解等过程向环境中释放化感物质，从而抑制周围一种植物或多种植物生长发育的现象。而植物通过挥发途径产生化感作用的现象很早就被关注并研究，Molish就是因为发现苹果产生的挥发性物质可以抑制许多植物的生长而对植物化感作用这一自然现象给予了科学的定义（金瑞等，2007）。Muller等也是通过对南加州海岸灌木释放的挥发物的研究，从而揭示了挥发性物质在化感作用中的价值，极大的推动了挥发性物质化感作用的研究（Muller等，1964）。目前研究已经发现了许多植物的挥发性成分具有化感作用，如张晓芳等（2011）研究发现白三叶（Trifolium repens）草的挥发物对稗草（Echinochloa crusgalli）和苘麻（Abutilon theophrasti）种子的萌发和幼苗生长均有显著的抑制作用；施蕊等研究发现薇甘菊（Mikania micrantha）挥发油对种子生长表现为低促高抑的双重浓度效应，低浓度的挥发油可以促进大豆（Glycine max）的根长和苗高生长，且质量浓度升高，表现为抑制作用（施蕊等，2014）；孔垂华等（1999）研究发现胜红蓟（Ageratum conyzoides）的挥发物对黄瓜（Cucumis sativus）、萝卜（Raphanus sativus）、番茄（Lycopersicon esculentum）等6种植物的萌发和幼苗生长均有显著的抑制作用，且在生长环境越恶劣的地方，化感抑制现象更为显著；杨晓璐等（2012）研究发现油蒿（Artemisia ordosica）的挥发油可以抑制红梗眼子菜（Potamogeton miniatus）的生长和光合作用。
雪松Cedrus deodara(Roxb.)G. Don，又称喜马拉雅雪松、香柏（安徽植物志协作组，1985），原产于喜马拉雅山脉，1920年开始引种到中国，目前并广泛用于荒山绿化，风景林绿化树种。野外调查发现，雪松纯林或单株下植被稀疏，与其他绿化树种相比，树下植物种类以及数量较少，甚至在其枝叶冠幅内的地表裸露，无任何植物定居，这严重影响了城市景观效果。近几年来，对松科植物挥发性物质的化感研究已有一些报道，如韩芬等研究了华北落叶松枝叶（Larix principis-rupprechtii）挥发性物质的化感作用，发现华北落叶松枝叶的自然挥发物和挥发油对自身种子萌发都表现出延迟萌发和抑制萌发作用，虽然对胚根和胚轴的伸长量、鲜质量减少的程度不同，但都产生明显的抑制作用（韩芬，2008）。吴俊民等（2000）研究了混交林中落叶松枯枝落叶对水曲柳（Fraxinus mandshurica）生长的影响，结果表明挥发性物质可显著抑制水曲柳的生长。但到目前为止，对雪松挥发性物质的研究主要集中药理活性、杀虫和抑菌等方面（白朝辉等，2012；扶巧梅等，2013；盖苗苗等，2010），而雪松枝叶挥发性物质是否与雪松树下植物种类稀少的原因有关，尚未有相关的研究报道。本文在半密闭干燥器中，以白菜（Brassica pekinensis）、萝卜和莴苣（Lactuca sativa）种子为受体，研究了雪松枝叶自然挥发物和挥发油的化感作用，探讨雪松树下植物难以生长的机制，旨在为雪松林群落结构和城区绿化等提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
2013年9月中旬，在安徽农业大学校园雪松林内采集雪松枝叶，树龄13年，采集树冠中部枝条上的枝叶，均为成龄枝叶，用保鲜袋密封带回实验室备用。大白菜、大青萝卜、莴苣种子均由安徽农业大学农学院提供，置于4 ℃冰箱保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 雪松枝叶挥发油的制备
采用水蒸气蒸馏法提取、收集挥发油（中华人民共和国卫生部药监委员会，2005），将新鲜阴干的雪松枝叶，剪碎至5 mm左右的长度，称取200 g于2000 mL的蒸馏水中，振荡混合均匀，浸泡湿润10 h，100 ℃提取4 h，得到有特殊香味的淡黄绿色的油状物，即为雪松枝叶的挥发油，出油率为0.34%(V/W)。将挥发油密封，置于-18 ℃保存待用。
1.2.2 雪松枝叶挥发物的化感作用生物测定
参照韩芬等（2008）的方法，在直径30 cm、高25 cm干燥器底部的干燥剂室内，分别放400 g新鲜的雪松枝叶或 1 mL的挥发油作为挥发物来源，对照的底部不放任何东西，在上部贮藏室内进行种子萌发实验。采用培养皿滤纸法，在直径为9 cm培养皿中铺上2层滤纸，然后均匀摆放大小一致已消毒的种子，白菜每皿40粒，萝卜每皿20粒，莴苣每皿60粒，加5 mL蒸馏水，3次重复，培养皿不上盖，干燥器加盖，在室内温度20～25 ℃自然光照下进行培养，每天补充适量的蒸馏水，打开干燥器通气30 min。每天记录萌发的种子数（以胚根突破种皮2 mm为萌发标准）。第5天时结束发芽实验，分别测量白菜、萝卜和莴苣的根长、芽长和干质量。
1.2.3 雪松枝叶挥发性物质的化学成分分析
采用GC-MS气质联用仪分析挥发油（王得道，2013）。色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度270 ℃，进样量1 μL，载气为氦气，分流比50∶1。色谱程序升温条件：起始60 ℃维持2 min，以5 ℃·min-1的升温速率，升至250 ℃，保持5 min，然后以10 ℃·min-1的升温速率，升至280 ℃，维持0.5 min。质谱条件：离子源为EI源，离子源温度是280 ℃，接口温度为250 ℃。电离电压70 eV，质量扫描范围50～550 amu。
采取静态顶空进样结合GC-MS分析自然挥发气体。准确称取5 g雪松枝叶放入20 mL顶空瓶，置静态顶空进样器中。进样条件：样品加热温度70 ℃，保持30 min，取样针温度75 ℃，然后给瓶加压15 psi，保持5 min捕集阱抽取挥发性成分500 μL。按照上述GC-MS条件分析。
1.2.4 保留指数（KⅠ）测定
将正构烷烃（色谱纯）样品（C8～C20）各取等量混合作为标样，然后按照1.2.3章节的GC-MS条件分析，记录下各正构烷烃的保留时间(min)，根据雪松挥发油和自然挥发物样品分析测定的保留时间，再根据线性升温保留指数计算公式算出各组分的保留指数：KI=100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)，其中tx、tn和tn+1分别为被分析组分和碳原子数为n和n+1的正构烷烃的流出峰保留时间(min)(tn 1.3 数据分析和统计方法 发芽率、发芽指数的计算式如下： 发芽率=(发芽种子数/供试种子数)×100% 发芽指数=∑(Gt/Dt)，式中：Gt为第t天的发芽数，Dt为相应的发芽天数。 生物活性测定参照 Williamson和 Richardson（1988）的方法，运用化感效应敏感指数（RI）来度量化感类型和强度，计算式为： RI=1-C/T(当T≥C)或RI=T/C-1(当T 生物测定中的单株数据取培养皿中各植株平均值，采用Excel、SPSS17.0等软件对发芽率、发芽势、发芽指数、根长、芽长和干质量进行分析，利用单因素方差分析与Duncan多重比较法，比较各处理间生物活性的差异显著性。 2.1 雪松挥发物对种子萌发的影响 雪松挥发物对3种受体种子的发芽率和发芽指数都有不同程度的抑制作用。其中自然挥发物对白菜、萝卜、莴苣种子的发芽率的抑制作用均不明显，仅比对照分别降低了1%、5%、2%，白菜和莴苣的发芽指数分别为72.93和49.18，分别比对照减少了15.08%和 21.32%，抑制作用达到显著水平，而对萝卜的发芽指数抑制作用不显著，仅比对照减少3%。而挥发油对白菜、萝卜、莴苣种子的发芽率和发芽指数均产生显著的抑制作用，其中对莴苣的萌发抑制最为明显，发芽率和发芽指数分别比对照降低92.85%和96.43%，其次是白菜，发芽率和发芽指数分别比对照降低14.5%和17.4%，抑制作用极显著，对萝卜的影响较弱，发芽率和发芽指数分别比对照降低10%和19%，但抑制作用均达到显著水平（表1）。 表1 雪松枝叶挥发物对3种受体种子萌发指标的影响Table 1 Effects of the volatile from leaves and branches of C. deodara on three kinds of seeds germination index 对化感效应指数进行简单的加和可看出（韩芬等，2008），挥发油对受体种子萌发的抑制作用大于自然挥发物，且对发芽指数的抑制作用大于发芽率。 表2 雪松松叶挥发物对3种受体植物萌发幼苗生长指标的影响Table 2 Effects of the volatile from leaves and branches of C. deodara on three kinds of seedling growth index 2.2 雪松挥发物对种子萌发幼苗的影响 在自然会挥发物处理下，白菜种子萌发的根长和芽长分别比对照减少19.2%和13.6%，抑制作用达到显著水平，干质量仅比对照减少 4.7%，抑制作用不明显；萝卜种子萌发的根长和干质量分别比对照减少1%和9%，抑制作用不显著，而萝卜种子萌发的芽长比对照减少20%，抑制作用达到显著水平；莴苣芽长的干质量比对照减少 4%，抑制作用不明显，芽长比对照降低了20%，抑制作用显著，根长比对照增加了 1%，有微弱的促进作用，但并没有达到显著性水平。在挥发油的处理下，白菜萌发的根长和芽长分别比对照减少51.3%和10.2%，抑制作用显著，干质量仅比对照减少 6%，抑制作用不明显；萝卜的根长和芽长分别比对照减少28%和14%，抑制作用显著，干质量仅比对照较少 7%，抑制作用不明显；莴苣萌发的根长比对照减少19%，但没有达到显著性差异，芽长比对照较少了43%，抑制作用显著，干质量仅比对照减少8%，抑制作用不明显（表2）。 对化感效应指数简单加和可看出，挥发油对3种植物种子萌发幼苗的抑制作用大于自然挥发物，自然挥发物对萌发幼苗芽长的抑制作用大于根长，而挥发油对萌发幼苗根长的抑制作用大于芽长，自然挥发物和挥发油对萌发幼苗干质量的抑制均不显著。 2.3 雪松挥发油化学成分分析 对雪松挥发油以及自然挥物采用 GC-MS分析，其GC-MS总离子流图见图1、2。 图1 雪松枝叶挥发油GC-MS总离子流图Fig. 1 GC-MS total ion current chromatograms of C. deodara volatile oils 图2 雪松枝叶自然挥发物GC-MS总离子流图Fig. 2 GC-MS total ion current chromatograms of C. deodara natural volatile 各组分相对含量采用峰面积归一化法来确定。对总离子流图中各色谱峰计算其KI值；利用各色谱峰对应的质谱图进行NIST11标准质谱库中检索比对，选取质谱匹配度高的10个可能物质，参考相关文献（白朝辉等，2012；巩丽丽，2011；刘红等，2013；任恒鑫等，2013；施蕊等，2014；田苗等，2014）查阅每种物质相对应的KI文献值，以KI文献值和KI测定值匹配度最高的化学结构为最佳鉴定结果（表3）。 从表3可见，采用水蒸气蒸馏提取的挥发油分离鉴定出37种化合物，占总挥发油的85%，其中单萜化合物11种，倍半萜化合物15种，醇类化合物5种，醛类化合物1种，酮类化合物1种，酯类化合物1种，氧化物2种，它们分别占总挥发油的57.86%，19.97%，5.65%，0.04%，0.05%，0.32%，0.54%，因此单萜和倍半萜是构成雪松枝叶挥发油的主要成分，其中含量较高的化合物有 α-蒎烯（24.72%）、β-蒎烯（21.04%）、1-石竹烯（12.42%）、柠檬烯（9.91%），α-松油醇（4.82%）。采用顶空进样GC-MS分析的自然挥发物，分离鉴定出21种化合物，占总挥发油的 53.41%，其中单萜化合物11种，倍半萜类化合物4种，醇类化合物1种，醛类化合物2种，酯类化合物1种，它们分别占自然挥发物的52.26%，0.52%，0.39%，0.05%，0.01%，因此单萜是构成雪松枝叶自然挥发物的主要成分，其中含量较高的化合物有 α-蒎烯（17.16%）、b-侧柏烯（13.06%）、β-蒎烯（11.53%）、D-柠檬烯（9.66%）。两种方法分析结果中有15种共有化合物，这些共有化合物在挥发油中占 65.89%，在自然挥发性成分中占 52.76%，其含量也不相同，α-蒎烯和 β-蒎烯在挥发油中的含量均高于自然挥发物，而 b-侧柏烯和 D-柠檬烯在挥发油中的含量要低于自然挥发物。 由表3可知，正己醛、反式-2-己烯醛、叶醇、(1S,3R)-顺式-4-蒈烯、3-蒈烯为自然挥发物中检测到的成分，而挥发油中没有检测到，其中后2种成分为萜类化合物，对热和光比较敏感，水蒸气蒸馏提取挥发油的过程中会使其发生氧化、重排，导致结构变化。 生物测定实验结果表明，雪松枝叶的自然挥发物对3种供试植物的萌发率影响甚微，但对发芽指数和萌发的芽长产生较明显的抑制作用，而挥发油对种子的萌发率、发芽指数以及萌发的根长和芽长均表现较强的抑制作用，说明雪松枝叶的挥发性物质存在潜在的化感作用，且通过水蒸气蒸馏所得到的雪松枝叶挥发油对3种植物的化感活性均比自然挥发物显著。种子发芽率和发芽指数对一个种群的更新至关重要，种子发芽率降低可能会降低该植物在群落中的密度；发芽指数降低，植物出苗延迟，直接影响该植物在群落中的竞争能力；根长和苗高变小，直接影响该植物的吸水吸肥以及对光的竞争能力，这些均会直接影响植物在群落的地位和作用（郑丽和冯玉龙，2005）。因此雪松枝叶通过挥发向外释放化感物质，抑制周围植物生长，使植物种类以及数量均较少，使其自身在竞争中处于优势地位。 表3 雪松枝叶挥发性物质的主要化学成分Table 3 Major chemical constituents of the volatiles from the leaves and breaches of C. deodara 经过GC-MS分析，雪松枝叶挥发油中鉴定出37种化合物，84.68%都为萜烯类化合物及其含氧衍生物；枝叶自然挥发物中鉴定出22种化合物，52.81%也都为萜烯类化合物，如α-蒎烯、β-蒎烯、1-石竹烯，柠檬烯，b-侧柏烯等，这一研究结果与盖苗苗等（2010）的研究结果一致。因此雪松枝叶挥发性物质对受体种子萌发和幼苗生长所表现的抑制作用，可能与挥发性物质中的萜烯类化合物有关。单萜和倍半萜多以挥发油形式存在，对昆虫具有引诱、忌避和传递信息等效应，还能杀菌和抑制周围邻近植物（孔垂华等，1999；盖苗苗等，2010；孔垂华和胡飞，2001；扶巧梅等，2010；王兰英等，2010）。有研究已经证实，萜类化合物是自然界中常见的化感物质，它们可以通过挥发、淋溶、分泌和植物残体分解进入环境，对植物种子和土壤生态环境产生作用而显著引起生物群落和生态系统发生变化（Muller等，1964；Kong等，1999；Feoa等，2002；彭少麟等，2002；王大力和祝心如，1996）。Bradow和Connick（1990）研究表明，植物精油中的蒎烯（α-蒎烯、β-蒎烯）、柠檬烯等萜类化合物能强烈的抑制种子萌发和幼苗生长。谷文祥等（1998）研究发现，蒎烯、柠檬烯等萜类除保护自身植物不受侵害外，对其它植物产生低促高抑的双重浓度效应。因此，雪松枝叶挥发物中确实存在化感物质，通过挥发途径抑制周围邻近植物生长，从而使雪松林下植被稀疏，生物多样性降低，群落结构简单。 比较挥发油和自然挥发物的成分发现，两者有15种共同化合物，除b-侧柏烯，α-水芹烯，D-柠檬烯外，挥发油中其它成分含量均高于自然挥发物，且挥发油中的成分种类要比自然挥发物中多，因此挥发油的化感活性显著高于自然挥发物，可能与其中成分组成种类以及成分浓度有密切关系。本实验采用顶空进样技术直接收集分析雪松枝叶挥发到体外的气体，较水蒸气蒸馏得到待测组分更能反应野外雪松枝叶释放挥发性气体的成分。水蒸气蒸馏在收集组分的过程中，可能使热稳性差的物质发生氧化、重排及聚合反应，导致结构变化，使自然状况下不易挥发的成分从枝叶中蒸馏出来，从而影响挥发性气体的成分组成，导致化感活性不同，不能真实的反应自然条件下的化感情况。因此，实验还需要在雪松的自然群落中对挥发性化感物质进行生物测定，其结果才能更真实的反应雪松的化感作用。 植物化感作用常是几个或几类化合物综合作用的结果，化感物质之间常常有拮抗或协同作用。本实验仅仅只是初步确定了雪松枝叶挥发物的成分和类型，而各单体化合物的化感活性及相互之间的作用还有待于进一步研究。 BRADOW J M, CONNICK W J. 1990. 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Allelopathic Effects and Chemincal Components of the Volatiles from Cedrus deodara Leaves and Branches LI Xiaofeng, JIAO Hui, YUAN Yi, TIAN Shengni* Allelopathy of the volatiles from isolated leaves and branches of C. deodara to seed germination of Brassica pekinensis, Raphanus sativus and Lactuca sativa were studied in a semi-closed container. The componenets of llelochemicals were determined by GC-MS. The results indicated that germination rate and dry weight of B. pekinensis, R. sativus and L. sativa were not significantly affected by the natural volatiles released by the leaves and branches of C. deodara, but seedling growth was significantly inhibited. The volatile oil from leaves and branches of C. deodara had significant inhibitory effects on the germination rate, germination index, root length and seedling length of seeds of these three vegetables. Germination rate and germination index of L. sativa were inhibited by 92.85% and 96.43%, respectively, while root length of B. pekinensis were inhibited by 51.3%, suggesting that there were potential allelochemicals in the natural volatiles released by the leaves and branches of C. deodara that inhibited seed germination, and that the allelopathic effect of volatile oil was stronger than natural volatile compounds. The chemical components of volatile oil and natural volatile were analyzed. In particular, 37 volatile chemical compounds were identified in volatile oil and 84.64% of these volatiles were α-pinene(24.72%), β-pinene(21.04%) and Caryophyllene(12.42%). 22 volatile chemical compounds were identified in the natural volatile and 52.81% of them were terpenes. The main components were α-pinene(17.16%), β-pinene(11.53%) and Bicyclo[3.1.0]hex-2-ene, 4-methyl-1-(1-methylethyl)-(13.06%). Both the volatile oil and natural volatile shared, but the volatile oil had relatively high terpene content. The components and chemical profile of volatile oil were both more than that of natural volatile, which might be a reason for the stronger allelopathic effect of volatile oil than than that of natural volatile. Seen from the results of analysis, terpenes were the main components of C. deodara that may be associated with the allelopathic effects. C. deodara; germination rate; germination index; terpenes 10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.02.013 Q948. 12+2.1 A 1674-5906（2015）02-0263-07 李晓凤，焦慧，袁艺，田胜尼. 雪松枝叶挥发性物质的化感作用及其化学成分分析[J]. 生态环境学报, 2015, 24(2): 263-269. LI Xiaofeng, JIAO Hui, YUAN Yi, TIAN Shengni. Allelopathic Effects and Chemincal Components of the Volatiles from Cedrus deodara Leaves and Branches [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(2): 263-269. 安徽省国土资源厅基金（2013-K-06）；安徽省生物学重点学科经费（2014QJK015） 李晓凤（1988年生），女，硕士研究生，主要从事化学生态学研究。E-mail：15155144827@163.com *通信作者：田胜尼（1971年生），男，副教授，博士，研究方向为植物生态学。E-mail：tiansn@ahau.edu.cn 2014-12-042 结果与分析
3 讨论
College of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
