液质联用技术在运动性中枢疲劳研究中的应用前景①

孙娟　张援　陈颖　官凌菊　赵君军　高照（广东省体育科学研究所　广东广州　510663）

液质联用技术在运动性中枢疲劳研究中的应用前景①

孙娟张援陈颖官凌菊赵君军高照
（广东省体育科学研究所广东广州510663）

摘 要：运动性疲劳是长期困扰运动员的一个棘手问题，运动性中枢疲劳与神经递质的关系已成为体育科研人员研究的一个热点。对运动性中枢疲劳与神经递质的关系、液质联用技术在神经递质检测方面的应用以及液质联用技术在运动性中枢疲劳研究中较其他检测技术的优越性进行综述，显示液质联用技术在运动性中枢疲劳研究中有着广泛的应用前景，促进对运动性中枢疲劳机制的认识和理解，以期为保障运动员处于最佳运动状态提供可靠的检测手段和科学的依据。

运动性疲劳一直都是运动训练学、运动生理学界研究的热点和难点。随着现代体育竞技水平的提高，训练强度越来越大，这种极限化训练模式必然给机体带来最大限度的疲劳[1]。如何有效地预防运动性疲劳的发生和促进疲劳的恢复，增强运动能力，确保运动员在比赛中保持最佳的竞技状态，一直是体育科学界所面临的一大难题。运动性疲劳分为外周疲劳和中枢疲劳，中枢疲劳被认为是中枢神经系统的保护性抑制，与中枢神经系统内神经递质的改变有关。运动性中枢疲劳是由长期的训练负荷、比赛和非训练应激因素与机体恢复不平衡等引起的[2]。近年来，随着脑科学和神经生物学的发展及新技术的应用，使运动性中枢疲劳机制的研究获得突破性进展，而运动性中枢疲劳的机制研究主要围绕着脑内神经递质的变化展开。

液相-质谱联用技术（Chromatography-MassSpectrometry）是20世纪90年代发展起来的一种综合分析技术，将液相色谱（LC）对复杂样品的高分离能力，与质谱（MS）的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与特征结构信息等优点结合起来，形成了较完美的现代分析技术。液质联用技术为神经递质及其代谢产物的定性鉴别和定量检测提供了一个高效、可靠的分析方法，利用该技术检测神经递质进行运动性中枢疲劳机制的研究也将成为未来的发展趋势。

1　运动性中枢疲劳与神经递质

神经递质是由神经细胞分泌并作为一种信使作用于效应细胞，使其发生特定功能改变的一类神经活性物质，广泛分布于哺乳动物和人体的中枢神经系统、脑组织和体液中，是神经调节和内分泌调节的信使，也是中枢神经系统产生的敏感性物质，与运动性中枢疲劳有着密切的关系。目前发现的中枢神经系统主要有氨基酸类、单胺类、胆碱类、肽类及嘌呤类神经递质[3]，现在研究者对运动性中枢疲劳机制的研究多集中在单胺类和氨基酸类两类神经递质。

1.1单胺类神经递质与运动性中枢疲劳

单胺类神经递质在运动过程中有着非常重要的作用，它们与运动能力的提高、机体协调性的保持紧密相关，并且也是运动性疲劳重要的中枢机制之一[4]。单胺类神经递质是含有芳乙胺结构的神经递质和神经调质，主要包括：多巴胺（dopamine DA）、肾上腺素（adrenaline Ad）、去甲肾上腺素（nor epinephrine NE）、5-羟色胺（5-HT）。通常人们又把多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素统称为儿茶酚胺（catecholamine CA），而把5-羟色胺称为血清素[5]。

有关单胺类神经递质与运动性中枢疲劳之间的关系已有大量的研究，一次性运动及其恢复期，脑内单胺类神经递质的含量都会发生一定的变化，而且它们之间的比值也可以用来评价运动性中枢疲劳。Newsholme[6]等首次提出了5-HT可能是中枢疲劳的调节物质，可以潜在的调节中枢神经系统的疲劳程度，他们的研究发现脑内5-HT浓度在长时间的运动后会升高，影响机体的其他调节作用，从而导致运动性中枢疲劳的发生，其中下丘脑和脑干部位的5-HT升高最为明显。赵丽等[7]通过测定一次力竭运动小鼠中枢单胺类神经递质去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）及其代谢产物多巴克（DOPAC）、5羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）含量的变化，以期为运动疲劳的中枢机制提供一定实验室依据。力竭时海马、皮层和脑干NE含量较安静时明显增加，而纹状体、下丘脑和小脑NE含量有降低趋势。海马、脑干组织中DA含量力竭时极显著地增加，皮层、纹状体区仅有增加趋势，而下丘脑DA含量较安静时则有降低趋势；DA的代谢产物DOPAC仅在脑干有明显增加。各个脑区力竭时5-HT均较安静时明显增加，其代谢产物5-HIAA在皮层、下丘脑及小脑也显著增加。候莉娟等[8]通过测定大鼠纹状体单胺类神经递质及多巴胺神经递质及其受体表达量在运动疲劳前后的变化，探讨纹状体多巴胺系统信号通路在运动疲劳后中枢调节中的作用，运动疲劳使大鼠纹状体区5-羟色胺、多巴胺与多巴胺Ⅱ型受体含量显著增高，多巴胺可能与Ⅱ型受体结合激活间接通路，影响锥体外系对运动功能的调节。

1.2氨基酸类神经递质与运动性中枢疲劳

氨基酸类神经递质可分为两类：一类为抑制性氨基酸递质，包括甘氨酸（Gly）、ɣ-氨基丁酸（GABA），这类递质是中枢神经系统出现保护性抑制的重要因素之一，因此它们在调节机体的兴奋状态、协调运动中枢的功能活动中发挥重要作用。另一类为兴奋性氨基酸递质，包括谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp），谷氨酸在谷氧酸脱羧酶的催化作用下脱羧生成ɣ-氨基丁酸（GABA），两者的代谢在正常生理条件下处于相对平衡状态。Glu和Asp含量的下降说明中枢系统兴奋性降低，原因可能是机体在过度疲劳状态下产生了抑制性保护，这样可以减弱兴奋性神经递质大量增加对神经元产生的毒害作用，还可以防止运动过程中机体代谢产物对中枢系统正常功能的影响[9]。

氨基酸类神经递质总量是指细胞内、外递质含量的总和，它反映的是中枢神经系统递质合成与释放的综合效应[10]。研究表明，机体运动前、后及恢复期，氨基酸类神经递质总量都会发生一定的变化，脑中GABA含量升高，Glu/GABA比值下降，影响中枢神经系统的兴奋与抑制过程，从而导致运动性中枢疲劳的发生。季浏提出[11]，白鼠长时间运动后（10h），大脑中的GABA含量显著增加，大脑兴奋性降低，中枢疲劳产生，表明脑中GABA含量升高引起的中枢抑制过程与长时间运动引起的疲劳密切相关。白宝丰等[12]研究了力竭运动前后大鼠脑皮质运动区氨基酸类神经递质总量的动态变化，发现力竭运动后即刻Glu总量有所下降，GABA总量显著上升至最高点；Gly总量在力竭运动后即刻、恢复0.5h、1h均显著性高于安静值，恢复期0.5h达到最高点，同GABA含量变化相比具有时相差异性；Glu/GABA比值在恢复期有所增高，而Glu+Asp/GABA+Gly比值始终低于安静值。说明大鼠脑皮质运动区Glu含量下降和GABA含量增高与运动中枢抑制过程密切有关；观察大鼠脑中Glu+Asp/ GABA+Gly比值变化，反映运动性疲劳时脑的机能状态，比Glu/ GABA比值更有意义。还有学者认为Glu/GABA比值变化可以在一定程度上反映脑内氨基酸类神经递质的平衡情况，影响神经生理功能的变化，用Glu/GABA比值来观察运动疲劳时脑的机能状态可能比单纯观察GABA意义更大[13-14]。

2　液质联用技术在神经递质检测中的应用

自20世纪90年代成套的液质联用仪问世以来，液质联用技术已在生物、医药、化工、环保等众多领域发挥着不可比拟的作用。近十多年来，随着LC-MS技术发展的日臻完善，其在神经递质检测中的应用也越来越广泛。如苏芬丽等[15]建立了LC-MS/MS法同时测定大鼠脑组织中5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟吲哚乙酸、3，4-双羟苯乙酸（DOPAC）、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇（MHPG）和高香草酸（HVA）7种单胺类神经递质及其代谢产物的含量，可用于神经精神疾病神经递质的研究与分析。该方法操作简单，流动相简单易配，灵敏度高和特异性好，两次进样只需17 min即可完成检测，因此更适合于临床科研工作中大批量样本的检测。李慧等[16]将大鼠脑海马组织匀浆后，匀浆液经盐酸正丁醇衍生化反应形成氨基酸丁酯，LC-MS-MS测定海马组织中氨基酸类神经递质ɣ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）的含量，在测定上消除干扰物质，而只特异性地检测以上几种氨基酸，达到精确定量的目的。张蕾等[17]建立了一种同时测定小鼠脑组织中多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、5-羟色胺、乙酰胆碱、ɣ-氨基丁酸和谷氨酸7种神经递质含量的LC-MS/MS分析方法，实现了3类神经递质的同时测定，且样品需要量小、操作简单；通过动物试验验证了所建立的LC-MS/MS分析方法的可靠性，并同时将该方法应用于酸枣果肉镇静催眠的药理作用机制研究。

3　液质联用技术在运动性中枢疲劳研究中的应用

液质联用技术检测神经递质不仅集中于医学领域，在运动医学、运动生理生化研究中的应用也较为广泛。如赵先恩等[18]用1，2-苯并-3，4-二氢咔唑-9-乙基氯甲酸酯作为柱前荧光衍生试剂，高效液相色谱质谱联用法测定A、B两组（A：安静对照组，B：运动训练组）4种取样状态（安静、运动1h、力竭即刻、力竭后恢复12 h）下的64只大鼠端脑组织中5种神经递质（谷氨酸、ɣ-氨基丁酸、多巴胺、5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸）的定量结果，实现了两种氨基酸类和3种单胺类神经递质的同时完全衍生与检测。测定结果表明：（1）5-HT运动后的含量变化与疲劳恢复密切相关，是引起中枢疲劳的重要神经递质；长期中等强度的运动训练能够促进5-HT的转化，并能显著提高大鼠耐力运动后的疲劳恢复能力。（2）长期的运动训练使大鼠适应了运动应激，力竭运动后B组比A组端脑中DA水平恢复速度明显。（3）虽然长期运动训练使大鼠的运动能力提高，但中枢神经保护性的抑制能力降低，GABA和GLU水平恢复到安静状态较缓慢。因此得出了长期中等强度的运动训练能够有效提高大鼠的运动能力及耐力运动后疲劳恢复能力的结论。刘洪珍等[19]选用8周龄大鼠64只，适应跑台训练1周后，随机分成两组（服药组和对照组），服药组灌服复方中药煎剂8周。然后，每组再分成4个亚组分别于不同状态下断头处死，用高效液相色谱-质谱联用仪，采用柱前衍生-高效液相色谱荧光检测法测定其端脑中5-HT、5-HIAA、DA、GLU和GABA 5种中枢递质含量，探讨复方中药制剂对运动大鼠中枢神经递质含量的影响，进一步认识中药提高运动能力和促进运动性疲劳恢复的作用机理。结果表明在大鼠运动至力竭的过程中，复方中药制剂能明显抑制5-HIAA、5-HT、DA、GABA的生成和促进GLU中枢递质的合成，其综合效应表现为兴奋性神经递质相对显著增多，中枢神经兴奋性增强、显著延长大鼠的运动时间和促进中枢疲劳的恢复。

4　液质联用技术在运动性中枢疲劳研究中的优势

神经递质的检测方法国内外报道较多的有高效液相色谱检测法[20]、高效液相色谱-电化学检测法[21]和高效毛细管电泳-激光诱导荧光检测法[22]等，但这些方法存在灵敏度欠佳、重现性不稳定、样品前期纯化处理耗时耗力等缺点。液质联用技术与这些检测技术相比具有其特有的优势：⑴具有高灵敏度和高选择性的优点，非常适合对神经递质进行定量分析。由于运动性中枢疲劳机制复杂，神经递质及其代谢产物的定量分析也越来越倾向于同时测定多种神经递质和同时测定不同类别的多种神经递质；液质联用技术采用液相与三重四级杆（LC-MS/MS）联用技术，通过选择离子检测（SIM）、多反应监测（MRM）等模式可以同时定量测定多种神经递质。⑵具有强大的分离及结构鉴定能力。中枢神经递质是一个非常复杂的化学体系，含有大量的次生代谢产物，其结构复杂，性质相似；液质联用技术可以分析化合物的结构，有助于对未知化合物进行定性分析，且灵敏度高，可以极大地促进运动性中枢疲劳机制研究。⑶液质联用技术可避免复杂、繁琐、耗时的样品前处理工作，通过多反应监测，大大提高分析的专一性，灵敏度高，重现性好，因此在中枢神经递质的定性与定量研究中显示出强大的优势。随着液质联用技术的不断成熟，必将会被更广泛地应用于运动性中枢疲劳研究中。

5　结语

液质联用技术在运动性中枢疲劳研究中的应用，能为进一步

揭示运动性中枢疲劳机制提供有效、可靠的数据和方法学支撑，以期为保障运动员处于最佳运动状态提供可靠的检测手段和科学的依据。同时随着科学技术的不断发展，液质联用技术与先进采样技术的联用，解决样品和检测这两个在运动性中枢疲劳研究中至关重要的环节，会进一步促进对中枢疲劳机制的认识和理解，寻找行之有效的预防或消除疲劳的方法，液质联用技术必将在运动训练监控和疲劳恢复等领域展现出更好的应用前景。

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关键词：液质联用技术运动性中枢疲劳神经递质检测

LC-MS Technique in Exercise-induced Central Fatigue Research

Sun JuanZhang YuanChen YingGuan LingjuZhao JunjunGao Zhao
（Guangdong Provincial Research Institute of Sports Science，Guangzhou Guangdong510663，China）

Abstract：Exercise fatigue is a thorny problem has long plagued the？athletes.The relationship between exercise-induced central fatigue and neurotransmitters has become a hot research in？sports scientific.The present review involved the relationship between exerciseinduced central fatigue and neurotransmitters，LC-MS technique application in the detection of neurotransmitter and the LC-MS technique superiority in the study of exercise-induced central fatigue in comparison with other detection techniques.It was shown that LC-MS technique has a broad application prospects in the study of exercise-induced central fatigue so as to promote awareness and understanding of the mechanism of exercise-induced fatigue， in order to provide a reliable detection methods and scientific basis to ensure the athletes in the best state of motion.

Keywords：LC-MS technique；Exercise-induced central fatigue；Neurotransmitters；Detection

作者简介：①孙娟（1981—），女，硕士，助理研究员，主要研究方向为运动生理生化。

中图分类号：G8

文献标识码：A

文章编号：2095-2813（2015）06（a）-0008-03