Mfn2基因过表达对人乳腺癌MCF－7细胞增殖及EGFR、EGF蛋白表达的影响＊

胡继卫，洪 慧，张景华，陈晶晶，李玉凤，张顺礼

河北省唐山市人民医院 乳腺外科（唐山 063001）

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一［1］。乳腺癌基因治疗是一种全新的生物疗法，可能成为临床重要的辅助治疗手段［2］。线粒体融合素基因－2（Mfn2）是我国学者陈光慧等［3］利用差异显示法得到的一个新基因，其产物可抑制血管平滑肌细胞增殖，并可通过活化线粒体凋亡途径促进血管平滑肌程序性细胞死亡［4］。研究［5］显示，Mfn2基因在正常乳腺组织中高表达，而在乳腺癌组织及细胞中表达显著降低，而过表达Mfn2基因可以显著抑制人乳腺癌 MCF－7细胞增殖。表皮生长因子受体（EGFR）及其配体表皮生长因子（EGF）在一系列恶性肿瘤的发生发展中起重要作用，研究证实高表达EGFR的肿瘤患者预后较差［6］。本研究旨在初步探讨Mfn2基因抑制乳腺癌细胞增殖的机制是否与抑制EGFR、EGF表达相关，为乳腺癌的基因治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 人乳腺癌 MCF－7细胞（武汉大学中国典型培养物保藏中心）；重组真核表达质粒pEGFP－Mfn2（华大基因公司制备）；pEGFP－N1质粒（华大基因公司制备）；引物（北京三博志远生物技术有限公司合成）。

1.1.2 试剂 DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶（美国Gibco公司）；青霉素、链霉素双抗（北京索莱宝公司）；Trizol、LipofectamineTM2000和 RT－qPCR试剂盒（美国Invitrogen公司）；琼脂糖、T4 DNA连接酶和2 000bp DNA Marker（美国Promega公司）；鼠抗人 Mfn2多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；兔抗人EGFR及EGF多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；免疫组化染色试剂盒SP－9000、DAB显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）；TritonX－100（美国Sigma公司）；逆转录cDNA第1链合成试剂盒（美国Fermentas公司）；限制性内切酶XhoⅠ、HindⅢ（TAKARA公司）；MTT、DMSO和PI（美国 AMRESCO公司）；10mg／mL RNaseA（北京索莱宝）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MCF－7细胞培养于DMEM 完全培养基（10%胎牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL链霉素），置于37℃、5%CO2的细胞培养箱培养。实验分为3组：对照组、pEGFP－N1组和pEGFP－Mfn2组。

1.2.2 质粒的构建及检测 人Mfn2基因序列的开放阅读框（ORF）特异性引物序列5＇端分别引入XhoⅠ和HindⅢ酶切位点序列。RT－PCR方法扩增出正常小鼠肝脏组织中全长Mfn2cDNA，大小为2 274bp。用XhoⅠ及HindⅢ双酶切和T4DNA连接酶连接，鉴定阳性克隆，然后测序。逆转录引物序 列 为：上 游 5＇－ATCCTCGAGGCCACCATG TCCCTGCTCTTTTCTCG－3＇；下游 5＇－ATCAAGC TTTCTGCTGGGCTGCAGGTACT－3＇。

1.2.3 质粒转染及转染效率检测 取对数生长期细胞，消化收集并调整细胞的密度为1.0×105个／孔接种于6孔板中，培养至80%融合度。加入不含血清DMEM培养基稀释的质粒4μg，终量为100μL，对照组不加质粒；用不含血清DMEM培养基稀释10μL LipofectamineTM2000至100μL，轻轻混合上述两液，室温中放置25min。随后加入800μL无血清DMEM轻轻摇匀加入细胞中。转染的细胞培养6h后，各孔加入1mL含20%血清的DMEM。48h后荧光显微镜检测各组转染效率。

1.2.4 RT－qPCR 检测各组中 Mfn2mRNA 的表达 转染的细胞培养48h后提取细胞总RNA定量。取1μg总RNA进行逆转录cDNA。RT－qPCR反应体系（20μL）：cDNA 1μL、SYBR Mix 10μL、上下游引物（各25mol／L）0.5μL、ddH2O补至20μL，冰上混合；94℃变性5min，94℃15s，60℃20s，72 ℃ 1min，共30个循环。内参GADPH。实验结果用Comparative Delta－delta Ct法定量分析。Mfn2引物：上游5＇－TTCCACAA GGTGAGTGAGC－3＇，下 游 5＇－TTAGCAGACA CAAAGAAGATGC－3＇；GADPH 引 物：上 游 5＇－GAG AGGGAAATCGTGCGTGAC－3＇，下 游：5＇－CATCT GCTGGAAGGTGGACA－3＇。

1.2.5 免疫细胞化学检测 Mfn2、EGFR、EGF蛋白的表达 对数生长期的细胞消化收集重悬，细胞调至密度4×104个／mL。12孔板每孔放置无菌玻片并滴加细胞悬液2mL培养2～3d，待细胞在玻片上爬至80%时，转染质粒pEGFP－Mfn2、空质粒pEGFP－N1，并设对照组。培养48h后，4%多聚甲醛固定 30min，加 0.3% 的 PBS－Triton X 作 用10min，3%H2O2作用10min，玻片置载玻片滤纸吸干，加5%BSA工作液封闭，37℃湿盒中孵育30min，滤纸吸去封闭液，不洗；分别滴加一抗（Mfn2为1∶20稀释，EGFR、EGF为1∶100稀释），对照组用PBS代替，放于湿盒中4℃过夜；滴加PV－6000二抗，37℃ 湿盒中孵育35min；DAB显色，自来水终止反应，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。以细胞质出现棕黄色或黄褐色颗粒为阳性，在高倍视野（×200）下，每张切片随机观察5个视野，计数每个视野阳性染色细胞，并计算其百分比。

1.2.6 MTT法检测各组细胞增殖情况 将MCF－7细胞按2×103个／孔接种于96孔板中，24h后转染质粒，每组3个复孔。对照组、pEGFP－N1组和pEGFP－Mfn2组每孔加入0.2μL质粒和0.5μL Lip 2000，补无血清DMEM至100μL，6h后每孔再加入100μL含20%血清的DMEM继续培养，同时设不加质粒及Lip 2000的空白对照组。分别在24、48h每孔均更换200μL 10%血清的DMEM，加入20μL 5mg／mL MTT，避光温育4h。去除旧培养基，所有孔中加入150μL DMSO，震荡10min溶解。在490nm处测吸光度（A）值。细胞增殖抑制率＝（1－实验组的A值／空白对照组的A值）×100%。

1.2.7 流式细胞术检测细胞周期 对数生长期的MCF－7细胞接种在25cm2培养瓶，每瓶1×106个细胞，培养24h。转染质粒，48h后消化收集细胞，75%冰乙醇固定过夜（4℃），上机前用预冷的PBS洗细胞3次并重悬。然后加入RNA酶、碘化丙啶（PI）避光染色15min，流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pEGFP－Mfn2质粒构建成功

PCR产物cDNA在琼脂糖凝胶电泳显示为2 274bp左右，与预测大小基本相符。测序结果显示重组表达质粒中插入的序列与已知的Gen Bank中Mfn2基因的序列基本一致，提示pEGFP－Mfn2质粒构建成功（图1）。

2.2 荧光显微镜检测各组转染效率

荧光显微镜检测3组细胞转染后的绿色荧光强度，结果显示转染空质粒pEGFP－N1组和pEGFPMfn2组转染率分别为（49.15±2.04）%，（51.10±2.18）%，均高于对照组（0.58±0.21）%，差异有统计学意义（P＜0.05），提示质粒转染成功。

图1 Mfn2开放阅读框PCR产物

2.3 RT－qPCR检测各组中 Mfn2mRNA的表达

与对照组和转染pEGFP－N1组相比，pEGFPMfn2质粒组Mfn2mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）（图2）。

图2 实时荧光定量PCR法检测各组中Mfn2mRNA的表达

2.4 免疫细胞化学检测Mfn2蛋白的表达

pEGFP－Mfn2组Mfn2蛋白表达率为46.00%，显著高于对照组15.00%及转染pEGFP－N1组12.00%，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.5 MTT法检测各组细胞增殖结果

转染24h后3组细胞增殖抑制率无显著差异（P＞0.05）。转染48h后，与对照组和pEGFP－N1组比较，pEGFP－Mfn2组细胞抑制率显著升高（P＜0.05）（表1）。

表1 3组细胞增殖抑制率比较（n＝3，%，±s）

表1 3组细胞增殖抑制率比较（n＝3，%，±s）

注：与对照组比较，＊＊P＜0.01；与pEGFP－N1组比较，＃＃P＜0.01

组别4.68±0.88 4.05±0.78 pEGFP－N1组 5.17±0.72 8.34±2.72 pEGFP－Mfn2组 5.58±0.81 68.63±3.12＊＊＃＃24h 48h对照组

2.6 流式细胞仪检测各组细胞周期分布

转染后对照组、pEGFP－N1组和pEGFP－Mfn2组G0／G1期细胞百分率分别为（62.00±1.41）%、（61.00±1.63）%和（69.75±0.96）%，与对照组及pEGFP－N1组比较，PEGFP－Mfn2组细胞 G0／G1期比例显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而空白组及转染pEGFP－N1组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。pEGFP－Mfn2质粒转染48h后，MCF－7细胞明显阻滞至G0／G1期。

图3 流式细胞术检测各组细胞DNA含量

2.7 免疫细胞化学检测EGFR和EGF蛋白的表达

对照组、pEGFP－N1组及pEGFP－Mfn2组EGF蛋白表达率分别为（84.12±13.45）%、（85.74±10.22）% 和（12.14±3.42）%，pEGFP－Mfn2 组EGF蛋白表达率显著低于其余两组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

对照组、pEGFP－N1组及pEGFP－Mfn2 组EGFR蛋白表达率分别为（86.45±9.04）%、（89.41±16.14）% 和（18.31±4.37）%，pEGFP－Mfn2 组EGFR蛋白表达率显著低于其余两组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

Mfn2又称为增殖抑制基因（HSG）［3］，是我国学者陈光慧通过差异显示技术获得的一个新基因，它的编码产物HSG／Mfn2可以通过抑制Ras信号传导途径使细胞周期阻滞于G0／G1期，从而抑制细胞增殖。研究证明HSG与多种疾病密切相关，近年来它作为一种抑癌基因得到人们的重视［8］。有研究应用免疫组化法检测HSG在结直肠正常黏膜、良性病变及恶性肿瘤组织中的不同表达变化，结果显示结直肠癌组织中HSG蛋白表达显著低于良性腺瘤和正常黏膜组织，提示HSG蛋白在结直肠癌演变中具有重要意义［9］。

基因治疗是指将外源功能基因导入患者的细胞中，以纠正先天代谢异常、提供新的功能或补偿基因缺失的治疗方法。乳腺癌基因治疗途径主要包括抑癌基因治疗、原癌基因治疗、多药耐药基因治疗，以及免疫基因治疗等，Mfn2导入治疗即抑癌基因治疗方法之一［10］。本实验在 MCF－7细胞中成功转染了质粒pEGFP－Mfn2，48h后用荧光显微镜检测结果显示转染效率约50%，并用RT－qPCR法和免疫细胞化学法检测到转染质粒pEGFP－Mfn2组Mfn2 mRNA和蛋白水平都显著升高，说明过表达Mfn2基因在 MCF－7细胞中成功转染且表达。随后用MTT法检测过表达Mfn2基因对MCF－7细胞增殖的影响，结果提示与对照组和转染空载体组相比，转染pEGFP－Mfn2质粒组48h后细胞生长受到明显抑制，且有显著性差异（P＜0.05），说明在 MCF－7细胞中过表达Mfn2基因可以抑制肿瘤细胞的生长和增殖，进一步证实了Mfn2基因能够抑制肿瘤的增殖。

细胞周期是细胞生命活动的一个基本过程，细胞分裂和DNA合成是细胞周期的两个主要事件。在本实验中，转染质粒pEGFP－Mfn2组 MCF－7细胞中G0／G1期占（69.75±0.96）%，显著高于空白对照组和转染穿梭质粒组，说明在MCF－7细胞内过表达Mfn2基因，能将细胞周期阻滞于G0／G1期，从而干扰细胞周期的进展，抑制癌细胞的增殖。大鼠的体内和体外研究［11－12］显示，Mfn2基因过表达能抑制血管平滑肌细胞增殖，细胞周期阻滞在G0／G1期，与本实验结果相符。

EGFR及其配体EGF在许多人类肿瘤中都有表达。EGFR与EGF结合后通过作用于Ras信号通路，影响与增殖相关的转录因子活化及基因转录，加速癌细胞的增殖及分化，从而促进细胞中DNA、RNA、蛋白以及细胞外大分子的合成，加速肿瘤细胞的增殖和分化程度，同时EGF还能诱导肿瘤细胞中EGFR的表达，进一步增加肿瘤细胞的恶性程度［7］。在乳腺癌中，EGFR的表达水平与较差的预后和较低的生存率相关［13－14］。用药物或者其他干预方法来阻断EGFR的活性，抑制其磷酸化和信号传导，能够起到多种途径的抗肿瘤作用，增强放、化疗的抗肿瘤疗效［15］。本实验表明，我们将过表达Mfn2基因转染入乳腺癌细胞后，EGFR、EGF表达显著降低，提示转染Mfn2基因后，导致了EGFR、EGF表达水平的下降，可能是通过抑制Ras信号通路，来影响与增殖有关的转录因子活化及基因转录的程度，抑制肿瘤细胞的增殖，降低肿瘤细胞的恶性程度。

综上所述，Mfn2基因过表达可抑制MCF－7细胞EGF与其受体EGFR的表达，将MCF－7细胞阻滞于G0／G1期，抑制癌细胞的增殖。

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