周围神经端侧缝合后再生轴突PSA-NCAM的表达及对趋化性的影响

虞　庆　蒋良福　丁　健　李志杰　王安远　陈一衡　李　士　林　康

温州医科大学附属第二医院育英儿童医院手外科，浙江温州325000

周围神经端侧缝合后再生轴突PSA-NCAM的表达及对趋化性的影响

虞庆蒋良福丁健李志杰王安远陈一衡李士林康

温州医科大学附属第二医院育英儿童医院手外科，浙江温州325000

目的观察端侧缝合后再生轴突表面唾液酸-神经细胞黏附分子（polysialic acid-neural cell adhesion molecule，PSA-NCAM）分子的表达，及其对趋化性的影响。方法雌性清洁级SD大鼠24只，分4组，正常对照组、端侧缝合组、电刺激组和PSA拮抗剂组。3个月后进行电生理检测，免疫组化检测再生轴突PSA-NCAM表达，肌肉组织学检测，神经元逆行荧光示踪观察运动神经元比例。结果正常组不表达PSA-NCAM，电刺激组明显高于端侧组（P＜0．05)，拮抗剂组与端侧组无显著差异。端侧组运动神经元比例为16．54%，短暂电刺激后运动神经元比例上升至29．25%（P＜0．05）。拮抗剂组运动神经元比例与端侧组无显著差异。结论端侧缝合再生的神经趋化性与再生轴突表面PSA-NCAM表达量相关，提高轴突PSA-NCAM的表达有助于改善再生神经的趋化性。

周围神经；神经再生；端侧缝合；唾液酸-神经细胞黏附分子

周围神经端侧缝合指将断离的周围神经的远侧断端，缝接在附近完整神经干的侧面，为神经修复提供了新的方法。我们在前期工作中证实了端侧缝合能有效促进神经再生[1,2]，同时发现再生神经在趋化性方面表现不明显。我们推测是由于侧方出芽时的新生轴突缺少引导特异性生长的识别分子。唾液酸-神经细胞黏附分子（polysialic acid-neural cell adhesion molecule，PSA-NCAM)是近年来发现的神经识别分子，在运动神经发育、损伤神经肌肉再支配中起到重要作用[3]。本研究将观察端侧缝合后再生轴突表面PSA-NCAM分子的表达及其对趋化性的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物

2013年9～12月间选取由温州医科大学SPF动物实验中心提供的健康雌性SD大鼠24只作为研究对象，均为体重230～250 g的健康清洁级大鼠。将上述大鼠置于室温18℃～22℃、湿度60%～70%、通风良好的同一清洁饲养室内进行饲养。

1.2实验方法

将24只小鼠随机分为四组：正常组（n=6）、实验组[端侧缝合组（n=6）、电刺激组（n=6）和PSA拮抗剂组（n=6）]。①端侧缝合组SD大鼠应用1%戊巴比妥钠（5 mg/100 g）腹腔麻醉后，固定，局部消毒，脱毛，沿上臂纵轴切开皮肤，显露深部肌皮神经，在肌皮神经根部切断。显露尺神经，用显微镊在其内后方撕开1 mm长的外膜，10倍显微镜下将肌皮神经与尺神经用“11-0”缝线作端侧缝合。②电刺激组在同样操作后，缝合口近端尺神经予短暂电刺激（20 Hz，1 h，意大利ESAOT公司的Reporter四道程肌电诱发电位仪）。③PSA拮抗剂组在神经端侧缝合并进行短暂电刺激后，缝合口局部应用PSA-NCAM的拮抗剂0．5 μL Endoneuraminidase-N（8．7 U/μL，上海，博奥派克生物）。④正常组显露肌皮和尺神经后，重新缝合关闭伤口。

1.3观察指标

各组大鼠饲养3个月后，重新麻醉，固定，进行电生理及组织学检测。

1．3．1电生理检测使用意大利ESAOT公司的Reporter四道程肌电诱发电位仪记录肱二头肌肌电图。在同一位置将刺激电极置于肌皮神经下方，肱二头肌肌腹饱满出插入同心针记录电极。使用3．20 mA的电流强度，0．5 ms的电流脉宽，刺激频率为2 Hz。

1．3．2检测再生轴突PSA-NCAM表达情况显露神经缝合处，正常组距肌皮神经根部5 mm，实验组距缝合点远端5 mm处取肌皮神经，均长约3 mm。常规给予10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片后采用免疫组化SP法，严格按照说明书中的操作步骤进行操作。采用美国IPP6．0专业图像分析软件对PSA-NCAM免疫组化结果中的光密度值进行测定。

1．3．3肌肉组织学检测将肱二头肌经10%甲醛固定，酒精脱水，石蜡包埋。在肌腹中部同样水平横向切片，厚5 pan，HE染色，LeicaDWLB2型显微镜观察，Leica FW4000图像分析软件测量肱二头肌肌纤维截面积。

1．3．4神经元逆行荧光示踪显露臂丛神经束支部，放大10倍显微镜下用1 μL微量注射器于实验组肌皮神经外膜下注射1 μL 3%Fluoro-Gold水溶液（Sigma公司，美国）。FG荧光染色3 d后，动物重新麻醉、固定后，通过心脏灌注多聚甲醛液体，背侧入路显露脊髓，完整切取颈5到胸1节段脊髓及背根神经节，固定并脱水后，行连续冰冻切片（Leica冰冻切片机，德国），用荧光显微镜（LeicaDWLB2型，德国）观察，荧光滤镜激发波长为330～380 nm，在这个激发波下神经元胞浆肉的Fluoro-Gold显示黄白色荧光（波长440 nm）。通过图像处理系统计数各组的前角运动神经元及背根感觉神经元。

1.4统计学处理

采用Stata 7．0统计学分析软件进行统计处理，设定可信水平95%。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，各组差异采用方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1电生理检测

端侧组肱二头肌CMAP最大波幅为正常对照组的28．59%，电刺激组为端侧组的2．24倍，经单因素方差分析各组差异有统计学意义（F=19．53，P＜0．01）。端侧组肱二头肌CMAP潜伏期较正常组减慢86．46%，电刺激组为端侧组的69．27%，经单因素方差分析各组差异有统计学意义（F=70．47，P＜0．01），见表1。

表1　肱二头肌CMAP最大波幅与潜伏期（x±s，n=6）

2.2各组PSA-NCAM的表达

对各组由免疫组化测得的光密度值进行比较，正常组不表达PSA-NCAM，经单因素方差分析各组差异有统计学意义（F=95．69，P＜0．01），见表2。

2.3肌肉组织学检测

端侧组肱二头肌纤维横截面积为正常组的82．97%，经单因素方差分析各组差异有统计学意义（F=4．78，P＜0．05），见表2。

表2　各组神经PSA-NCAM的表达（光密度值）和肱二头肌纤维截面积（x±s，n=6）

2.4实验组神经元逆行荧光示踪

电刺激组运动神经元数目增加，经单因素方差分析各组差异有统计学意义（F=78．87，P＜0．01）。各组感觉神经元差异无统计学意义（F=0．14，P＞0．05）。神经元总数差异有统计学意义（F=13．9，P＜0．01），见表3。在各组运动神经元数目中，端侧组运动神经元比例为16．54%，电刺激组运动神经元比例上升至29．25%，拮抗剂组运动神经元比例减至18．21%。

表3　实验组运动神经元数目及比例（x±s，n=6）

3　讨论

周围神经端侧缝合为我们提供了神经长段缺损修复的新方法，是指将断离的周围神经的远侧断端，缝接在附近完整神经干的侧面。与传统神经端端缝合比较具有的优点包括：①对供体神经影响很小；②缩短神经再生时间，可以选择距损伤神经靶器官较近的完整神经作为供体神经；③操作简便。

大量实验研究证实了周围神经端侧缝合的有效性[4,5]，但是临床报道各家不一。Millesi等[6]报告9例臂丛上干损伤应用膈神经、副神经、肩胛背神经以端侧方法分别移位至胸前内侧神经、肩胛上神经及腋神经，结果8例相应肌力恢复达M3以上，仅1例肌力恢复为M2。而Pienaar等[7]报道10例患者，16个月后运动感觉均无明显恢复。因此有必要进一步研究周围神经端侧缝合后神经再生规律，从而提高功能恢复效果。

周围神经损伤后功能恢复的关键因素是再生神经纤维能否特异性地长入对应的靶器官，Hoke等[8]发现运动神经纤维再生轴突有倾向性地长入运动神经到达肌组织而非皮肤，此即倾向性运动神经再支配（preferential motor reinnervation，PMR）现象。神经趋化性是解决周围神经再生后选择性再生的希望和关键。目前认为影响周围神经趋化性的因素包括[9]：①远端的神经纤维通道；②靶器官分泌的神经营养因子；③近端的神经元胞体。

PSA-NCAM是一类介导黏附的膜表面糖蛋白，主要存在于胚胎发育期，在神经元发育中起重要作用，可能与突触的重排和可塑性有关。在成年期，PSANCAM的表达限制在保留可塑性的区域。现已证明PSA-NCAM介导的作用能导致细胞内级联信号系统的激活，对神经细胞的生长分化、轴突出芽、突触修饰和神经信号传递都发挥了重要作用，同时在运动神经发育、损伤神经肌肉再支配中起到重要作用。Franz等[10]研究表明，损伤后再生的运动神经轴突表面PSA-NCAM呈高表达，同时PSA-NCAM的高表达对再生神经趋化性是必须的。

我们研究小组在前期工作中发现神经端侧缝合后再生神经趋化性不明显[1,2]。本研究中我们发现周围神经端侧缝合后再生轴突表面表达PSA-NCAM，短暂电刺激能显著提高PSA-NCAM的表达，同时短暂电刺激能提高端侧缝合再生神经趋化性，局部应用PSA拮抗剂后再生神经趋化性下降。这些结果初步表明端侧缝合再生的神经趋化性与轴突表面PSA-NCAM的表达相关，提高轴突PSA-NCAM的表达有助于改善再生神经的趋化性。

综上所述，周围神经损伤是临床常见疾病，不仅给患者带来了巨大的痛苦，也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。我们的研究将进一步揭示周围神经端侧缝合后神经再生的规律，为临床提高周围神经修复效果提供新的途径。

[1]虞庆，王涛，顾玉东.神经端侧缝合后趋化性的神经元逆行示踪研究[J].中华显微外科杂志，2009，32（1）：36-38.

[2]虞庆，王涛，罗鹏波，等.周围神经端侧缝合后神经再生及其趋化性的实验研究[J].中华手外科杂志，2007，23（1）：30-33.

[3]Soundararajan P，Miles GB，Rubin L L，et al.Motoneurons derived from embryonic stem cells express transcription factors and develop phenotypes characteristic of medial motor column neurons[J].J Neurosci，2006，26（12）：3256-3268.

[4]Haastert K，Joswig H，Jaschke KA，et al.Nerve repair by end-to-side nerve coaptation：Histologic and morphometric evaluation of axonal origin in a rat sciatic nerve model[J]. Neurosurgery，2010，66（3）：567-576.

[5]Silva DN，Coelho J，Frazilio FO，et al.End-to-side nerve repair using fibrin glue in rats[J].Acta Cir Bras，2010，25（2）：158-162.

[6]Millesi H，Schmidhammer R.Nerve fiber transfer by endto-side coaptation[J].Hand Clin，2008，24（4）：461-483.

[7]Pienaar C，Swan MC，De Jager W，et al.Clinical experience with end-to-side nerve transfer[J].J Hand Surg Br，2004，29（5）：438-443.

[8]Hoke A，Brushart T.Introduction to special issue：Challenges and opportunities for regeneration in the peripheral nervous system[J].Exp Neurol，2010，223（1）：1-4.

[9]Madison RD，Robinson GA，Chadaram SR.The specificity of motor neurone regeneration（preferential reinnervation）[J]. Acta Physiol（Oxf），2007，189（2）：201-206.

[10]Franz CK，Rutishauser U，Rafuse VF.Polysialylated neural cell adhesion molecule is necessary for selective targeting of regenerating motor neurons[J].J Neurosci，2005，25（8）：2081-2091.

PSA-NCAM expression of peripheral nerve regeneration axon after endto-side neurorrhaphy and the influence on chemotaxis

YU QingJIANG LiangfuDING JianLI ZhijieWANG AnyuanCHEN YihengLI ShiLIN Kang
Department of Orthopaedics,the Second Affiliated Hospital&Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou325000,China

Objective To examine the expression of PSA-NCAM and neurotropism after end-to-side neurorrhaphy．Methods A total of 24 female Sprague-Dawley rats were divided into 4 groups,normal group,end-to-side neurorrhaphy group,electrical stimulation group and PSA antagonist group．Post operation,electrophysiology,histology of the muscle,PSA-NCAM stain and retrograde Fluoro-Gold neuron tracing after three months were conducted．Results Normal group did not express PSA-NCAM,it showed that in the electrical stimulation group,PSA-NCAM was higher than end-to-side group(P＜0．05),antagonists and end-to-side group had no significant difference．Retrograde neuron tracing demonstrated that motor neuron counts in electrical stimulation group was 29．25%,higher than end-to-side group (16．54%,P＜0．05)．Motor neuron proportion in antagonist group and end-to-side group had no significant difference．Conclusion Neurotropism after end-to-side neurorrhaphy is related with PSA-NCAM expression．Therapeutics aimed at increasing PSA-NCAM levels on regenerating motor axons may lead to superior funtional outcomes．

Peripheral nerves;Nerve regeneration;End-to-side neurorrhaphy;Polysialic acid-neural cell adhesion molecule

R73-3

A

1673-9701（2015）07-0014-03

浙江省自然科学基金资助项目（LY12H06005）

（2014-05-05）