间接免疫荧光法检测幼儿呼吸道合胞病毒感染结果分析

吴春兰 吴建芬

[文章编号] 1672-8270(2015)03-0070-04 [中图分类号] R446.6 [文献标识码] A

间接免疫荧光法检测幼儿呼吸道合胞病毒感染结果分析

吴春兰①吴建芬②

[文章编号] 1672-8270(2015)03-0070-04 [中图分类号] R446.6 [文献标识码] A

目的：分析间接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒(RSV)感染结果，为本地区儿童感染RSV提供详细的研究数据。方法：采用间接免疫荧光法对2009-2010年化州地区急性呼吸道感染患儿的21 458份咽拭子样本进行检测，分析RSV感染结果。结果：间接免疫荧光法检测RSV感染，特异性以及敏感度均较高，与其他呼吸道病毒无交叉反应。2009年共有临床标本10 477例，经间接免疫荧光法检测，RSV感染阳性检测率为9.73%。RSV感染阳性检测率有2个高峰，分别为每年的2月和12月，阳性率为11%。临床中＜6岁的幼儿RSV的感染最高。结论：间接免疫荧光法具有检测方便，特异性及敏感度高等优点，可用于临床对RSV感染的检测。

间接免疫荧光法；呼吸道合胞病毒；感染

DOI∶ 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.03.023

[First-author’s address] Huazhou Maternity and Child Care Hospital, Huazhou 525100, China.

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)属于单股负链RNA病毒，是临床上诱发婴幼儿下呼吸道感染的一种较为多见的病原体，全球各地均有过RSV感染的暴发[1]。以往临床上对于RSV的诊断，多是通过发现敏感细胞系培养中存在特征性的致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)来确定。但其培养周期较长，且受到多种因素的感染，检测结果的灵敏度并不高[2]。

随着分子生物学技术的飞速发展，目前多种新技术被用于临床诊断RSV，而间接免疫荧光法是目前国内外使用较多的一种检测RSV的方法[3-4]。本研究采用间接免疫荧光法检测RSV，并对2009-2010年化州地区急性吸道感染患儿的临床标本进行RSV的检测，旨在为本地区儿童感染RSV提供详细的研究数据。

1 资料与方法

1.1 病毒株与标本来源

(1)病毒株RSV由中国科学院武汉病毒研究所提供，为标准毒株Long株，其他急性吸道感染患儿的呼吸道病毒有A、B型流感病毒。

(2)对2009-2010年化州地区急性呼吸道感染患儿的21 458份鼻咽分泌物(nasopharyngeal secretions，NPS)样本进行检测。患儿年龄均＜14岁，采集的标本中放入含双抗与两性霉素的1640取材液中，并送至实验室。

1.2 病毒分离及鉴定方法

在无菌条件下，将收集的标本充分捣碎，使用离心机(1500 r/min)离心10 min，吸取上清液接种于传代HeLa细胞管。每份标本接种2管，采用Hep-2细胞培养法，0.1 ml标本上清液接种于Hep-2细胞，置于35℃温箱中培养，以出现细胞病变为判断病毒存在的指标。2周后若未发生细胞病变者，再盲传2代，若仍无细胞病变者则表明阴性结果。

1.3 NPS脱落细胞中RSV抗原快速检测

(1)细胞涂片制备。将NPS置于2 ml的Hank's溶液内，使用离心机(1500 r/min)离心10 min，弃上清液，留下少许液体。将沉渣制备成悬液，并涂在干净的载玻片上，每份标本分别涂在4张载玻片上，每片涂布4个小圆点，然后吹干，使用冷丙酮4 ℃下固定10 min，并置于干燥处备用。将RSV Long株感染的HeLa细胞以及未感染的HeLa细胞同时制备成阳性细胞涂片以及阴性细胞涂片，作为对照。

(2)免疫血清处理。HeLa细胞兔抗RSV血清，采用0.01M pH值为7.4的PBS将血清稀释1倍，与HeLa细胞进行混匀，使细胞最终浓度为6×106/ml。然后将样本置于37 ℃水浴中1 h，并进行间断摇动。使用离心机(2500 r/min)离心10 min，收集上清液并放置于4℃的冰箱内备用。作为研究对照的正常兔血清根据上述方法用HeLa细胞吸收。

(3)间接免疫荧光法检测。NPS脱落细胞中RSV抗原检测使用间接免疫荧光法进行。一抗为兔抗RSV免疫血清(效价1∶80)，二抗分别为异硫氰酸荧光黄标记的羊抗兔抗体(效价1∶20)以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，底物使用3.3-二氨基联苯胺。用间接免疫荧光法检测RSV抗原均根据盲法进行结果的判断，以标本中出现有2个以上的典型阳性细胞视为RSV抗原阳性。

(4)间接免疫荧光法检测RSV抗原形态特征。RSV抗原阳性细胞浆或胞膜上出现有大小不等的颗粒状果绿色荧光，有时呈星月状荧光，有的胞浆全部呈现荧光。

2 结果

2.1 间接免疫荧光法特异性与灵敏度

(1)经过检测，发现RSV阳性标本在建立的反应体系中呈现较好的S型扩增曲线，对其他呼吸道病原体阳性的标本以及Hep-2细胞进行检测，结果均为阴性，未出现交叉反应。

(2)经过检测，间接免疫荧光法检测RSV的灵敏度为5 pfu。

2.2 RSV检测结果

(1)2009年RSV感染情况分析。2009年全年共检测标本10 477份，其中RSV阳性标本760份，检测阳性率为7.25%。当年有6个月的RSV感染率在7.0%以上，其中RSV感染的高峰期在3月，感染率达到20.04%。

(2)2010年RSV感染情况分析。2010年全年共检测标本10 981份，其中RSV阳性标本1069份，检测阳性率为9.73%。当年有5个月的RSV感染率在7.0%以上，其中，RSV感染的高峰期在2月和12月，感染率分别达到29.56%和20.04%，如图1所示。

图1 2009年和2010年化州地区呼吸道合胞病毒感染检测分布图

(3)不同年龄阶段RSV感染情况分析。2009年1069份RSV检测阳性标本中，1～6个月大的婴幼儿RSV的临床感染率最高，达到54.1%。＞3岁的儿童RSV感染率显著降低，见表1。

表1 2010年1069例呼吸道合胞病毒感染年龄分布[例(%)]

3 讨论

目前研究显示，RSV是导致婴幼儿急性下呼吸道感染的一个重要病毒病原，亦是造成流行性喘憋性肺炎发生的重要病原[5]。目前，采用单克隆抗体能够将RSV具体区分为A、B两种亚型。其中，A亚型患者疾病发生较急，病情较重；B亚型患者病情则相对较轻。目前研究发现，RSV包膜的表面存在两种糖蛋白，分别是G蛋白以及F蛋白。前者主要具有吸附宿主细胞的能力，两种蛋白均是RSV感染时较为重要的免疫原[6-7]。有研究认为，RSV两种亚型之间的抗原性以及氨基酸序列的差异性主要集中在G蛋白上，不同亚型之间的RSV G蛋白中的抗体，并不能提供有效的亚型间的交叉保护作用。因此，临床研究中需要大量积累RSV以及其亚型流行病学的相关资料，明确RSV的流行趋势以及致病特征，从而为RSV疫苗的开发及预防提供可靠的策略及依据。一般情况下，RSV接种到敏感细胞3～7 d后，就会发生细胞病变效应。主要的特征是融合细胞组成更大的合胞体，并可在细胞质内见到嗜酸性颗粒，能够作为临床诊断RSV感染的一个重要依据[8-9]。但是，随着研究的深入，临床发现上述方法验证病毒是否复制需要的时间较长。对于临床治疗而言，随着时间的延长，早期诊断、早期治疗RSV的意义也会失去。

间接免疫荧光法是目前临床上用于检测病毒的一种新型方法，优点在于对检测病毒抗原较为敏感[10-11]。但是，间接免疫荧光法检测时，可能在结果判定上存在主观性，容易出现假阳性或假阴性的结果。随着临床研究的深入，间接免疫荧光法亦得到一定的发展，已经具有高灵敏度、高特异性以及高精确等优点，避免了其他检测技术的诸多问题[12-13]。此外，采用间接免疫荧光法技术，能够在标本获取的当天完成RSV的检测，为临床提供快速的实验室诊断。通过实验，说明建立间接免疫荧光法的特异性较好，与其他常见呼吸道病毒之间无交叉反应。

通过对化州地区两年的RSV感染监测发现，本地区1-4月份属于RSV较为活跃的时间，RSV流行的高峰往往出现在1-4月份，但是该结果并不是一定的，因为在2010年12月份也出现了一次RSV感染的流行。关于这一现象，以往的报道中较为少见，有学者报道，发现一些地区的RSV B亚型的G蛋白发生变异，而变异后的病毒促进了RSV的流行。本研究中，12月份RSV的流行是否与G蛋白变异有关，尚有待临床的进一步研究[11]。目前研究发现，RSV是造成全球范围内儿童及成人呼吸道感染的重要病原，甚至是首要病原[12]。正如图1所示，2009年全年有6个月的RSV感染率在7.0%以上，而2010年全年有5个月RSV感染率在7.0%以上，表明目前RSV的感染仍维持在一个较高的水平。本研究的结果显示，在婴幼儿的RSV感染中，＜6个月的婴幼儿感染率最高，与一些文献报告的结果相似[13]。随着检测技术的更新，使用间接免疫荧光法，可以更灵敏、更准确的检测病毒感染的情况，及时将结果反映到临床，为疾病的诊疗提供可靠的实验室支持。

综上所述，间接免疫荧光法具有检测方便。特异性及敏感度高等优点，可以用于临床对RSV感染的检测。2009-2010年，RSV感染仍是化州地区儿童急性呼吸道感染的主要病原。

[1]Rochelet M，Solanas S，Grossiord C，et al.A thin layer-based amperometric enzyme immunoassay for the rapid and sensitive diagnosis of respiratory syncytial virus infections[J]. Talanta，2012，100：139-144.

[2]Canziani GA，Melero JA，Lacy ER，et al. Characterization of neutralizing affinitymatured human respiratory syncytial virus F binding antibodies in the sub-picomolar affinity range[J].J Mol Recognit，2012，25(3)：136-146.

[3]谢鹤，王朋朋，李贵才，等.儿童重症肺炎病原体检测与诊治分析[J].中国小儿急救医学，2014，21(5)：281-284.

[4]吴茜，温柏平，李杨方，等.1402例小儿急性下呼吸道感染多病原学临床研究[J].中华妇幼临床医学杂志：电子版，2012，8(3)：312-316.

[5]周逞丽，杨翠云.免疫荧光法在检测呼吸道病原抗体(IgM)中的应用[J].中国医师杂志，2014(6)：795-797.

[6]俞晓春，胡荣盛，汪金云，等.958例儿童急性呼吸道感染九种病原体IgM抗体检测结果分析[J].实用预防医学，2014，21(1)：103-105.

[7]胡伟，代琼，胡孝彬，等.9项呼吸道病原体检测在呼吸道感染病因分析中的应用[J].国际检验医学杂志，2013，34(23)：3158-3159，3161.

[8]林传俊，左芳，汪宏良，等.1503例9种呼吸道感染病原体检测结果分析[J].国际检验医学杂志，2013，34(10)：1254-1255.

[9]薛白，刘洁，胡志刚，等.呼吸道感染患者病原学调查分析[J].中华医院感染学杂志，2014，24(2)：309-311.

[10]Cruz-Sanchez TM，Haddrell AE，Hackett TL，et al.Formation of a stable mimic of ambient particulate matter containing viable infectious respiratory syncytial virus and its drydeposition directly onto cell cultures[J].Anal chem，2013，85(2)：898-906.

[11]周艳，杨朝.贵阳地区儿童急性下呼吸道感染病原学研究[J].山东医药，2013，53(1)：62-64.

[12]廖冰洁，周迎春，李翠，等.呼吸道病原体IgM抗体联合检测在呼吸道感染诊断中的应用[J].国际检验医学杂志，2014(10)：1339-1340.

[13]Villenave R，Thavagnanam S，Sarlang S，et al.In vitro modeling of respiratory syncytial virus infection of pediatric bronchial epithelium，the primary target of infection in vivo[J].Proc Nati Acad Sci USA，2012，109(13)：5040-5045.

Infection results analysis of immunofluorescence method detection of RSV

WU Chun-lan,WU Jian-fen// China Medical Equipment,2015,12(3)∶70-73.

Objective∶ To analyze the infection results of The immunofluorescence detection of respiratory syncytial virus (RSV) in huazhou region from 2009 to 2010. Methods∶ The N gene sequence of RSV was taken as a reference to design specific primers and TaqMan fluorescent probe and to establish real-time The immunofluorescence method to detect sensitivity and specificity.21548 swab samples of children with acute respiratory infections in huazhou region from 2009 to 2010 were tested with real-time fluorescence. The immunofluorescence method. Results∶ The specificity and sensitivity of real-time fluorescence. The immunofluorescence method for detection of RSV infection were higher, without cross-reactivity to other respiratory viruses.10,477 cases of clinical specimens in 2009 were detected, with positive RSV infection rate of 9.73%, by real-time The immunofluorescence method detection. Positive detection rate of RSV infection had two peaks, which lied in February and December; the positive rate was 11% and 11% respectively. RSV infection rate was the highest for children under 6 years old. Conclusion∶ Real-time fluorescence features convenient detection, high specificity, and high sensitivity, which can be used for clinical detection of RSV infection. From 2009 to 2010, RSV infection remains a major pathogen of acute respiratory infections in children in huazhou region.

Immunofluorescence method; Respiratory syncytial virus; Infection

吴春兰,女,(1973- ),中专，主管技师。化州市妇幼保健院检验科，从事农村基层检验研究工作。

2014-10-31

①化州市妇幼保健院检验科 广东 化州 525100

②深圳市龙华人民医院民治社康中心检验科 广东 深圳 518131