高效液相色谱仪的应用分析*

宋学英 杨 华 赵逸松 唐静成

高效液相色谱仪的应用分析*

宋学英①杨 华①赵逸松①唐静成②*

目的：分析和解决高效液相色谱在使用过程中出现的多种技术问题。方法：总结高效液相色谱技术在使用过程常发生的柱压力不稳、基线噪音增大、色谱柱柱效下降以及化合物保留时间漂移等问题，提出了简单有效的解决方法。结果：通过分析判断，解决了高效液相色谱的技术问题，有效提高了仪器完好率和使用率，保证科学研究和教学工作的正常进行。结论：高效液相色谱仪的正确使用、保养和维护可以延长仪器的使用寿命，发挥仪器设备的最大效益。

高效液相色谱；故障分析；解决方法

[First-author’s address] Medical experiments and testing center, Capital Medical University, Beijing 100069, China.

高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)仪具有高分离效率、高选择性和高灵敏度特点，目前已成为化学、生物化学、医药卫生、石油化工和环境保护等领域中不可缺少的检测工具。然而，HPLC仪在使用过程中常会出现一些故障，如不能及时处理则会严重影响仪器的正常使用，从而阻碍实验进展。本研究在介绍HPLC仪工作原理的基础上，重点分析HPLC技术中常见故障的发生原因，并提出相应的解决方案。

1 HPLC仪的工作原理

HPLC仪是由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等组成。流动相通过高压泵注入色谱柱，由于样品中不同组份在色谱柱中分配系数的不同，使得各组份在色谱柱中差速分离，被分离的每一单一组分逐一通过检测器检测，所得信号经过数据处理系统记录并加以存储和计算，从而完成整个分析过程(如图1所示)。

图1 高效液相色谱仪工作原理示图

2 HPLC仪应用中的问题分析及其解决方法

2.1 色谱柱压力不稳

HPLC仪使用过程中最常出现的问题之一为色谱柱压力不稳，其原因为：①溶剂过滤头被污染，由于水相非常容易生长霉菌，若溶剂过滤头长时间浸泡在水相中则会被污染。解决方法是将溶剂过滤头拔下，分别用水、甲醇溶剂及超声清洗，如果过滤头为玻璃材质则不能超声清洗，应采用30%的硝酸浸泡，然后用去离子水清洗至中性；②单向阀被污染，单向阀的基本工作原理是流动相只能从阀的一端流入，另一端流出，即液体呈单向流动。单向阀的主要部件为宝石球和宝石球座，在使用含缓冲盐的流动相后，若单向阀球座上有无机盐细小固体颗粒的析出，会导致宝石球与球座密封性不好、流动相发生回流现象以及色谱柱压力不稳。解决方法是将单向阀小心拆卸下来，放入一盛有纯净水的小烧杯中，超声15 min；将水换为甲醇，再超声15 min，按指示方向装入仪器即可[1-5]。

2.2 基线噪音增大

实验过程中基线噪音增大的原因为：①紫外检测器中氘灯的灯能量过低，解决方法是查看230 nm处的灯能量值，如能量值过低更换氘灯即可；②检测器中的流通池被污染，判断流通池是否被污染，可观察参比池与样品池灯能量的比值，若检测器中的流通池被污染，样品池的灯能量会远远低于参比池的灯能量，解决方法是将色谱柱卸下用一个两通将系统连接起来，然后分别用去离子水、甲醇或乙腈和异丙醇冲洗流通池，流速为1 ml/min。观察样品池和参比池的灯能量，当样品池灯能量达到参比池灯能量的70%～80%时提示检测器的流通池冲洗干净，基线噪音可恢复到正常水平；③如方法②不能使流通池冲洗干净，可使用35%磷酸溶液和30%的硝酸溶液冲洗流通池，然后用纯净水将流通池和溶剂过滤头冲洗至中性，最后用100%甲醇冲洗流通池和系统，此法可将检测器中的流通池清洗干净[2-6]。

2.3 色谱柱柱效下降

新的色谱柱使用时应先用甲醇冲洗30 min，然后用标准样品在HPLC仪上测试其性能，并记录色谱柱的柱效。色谱柱使用一段时间后可根据污染物不同分别处理(见表1)。

表1 反相色谱柱被不同污染物污染的处理方法

图2 色谱柱再生前、再生后及固定相修补后苯的色谱图

实验中出现肩峰、拖尾峰甚至是分叉峰，提示色谱柱分离效能会降低。此时再用最初使用的同一标准样品测试其性能，柱效下降，表明色谱柱或是色谱预柱被污染。拆下色谱预柱运行样品此现象消失，表明是色谱预柱被污染，直接更换预柱即可；如果此现象任然存在，则可能是色谱柱被污染(如图2a所示)，经再生后的效果如图2b所示。如果用上述方法仍不能解决问题，可能是色谱柱进样口端的填料被污染，此时只能通过去掉进口端的部分填料，填入新的同品牌、相同颗粒的固定相，将色谱柱拧紧，用甲醇或乙腈反复冲洗，让固定相填充紧实、均匀，通过修补色谱柱提高柱效(如图2c所示)[7-14]。

2.4 保留时间漂移

高效液相色谱数据采集过程中，同一化合物保留时间的改变是很多液相色谱使用者常碰到的问题，化合物保留时间增大和减小的现象均有发生，原因有多种：①系统未平衡，应使用充足时间和流动相体积来平衡色谱柱，每次开机使用时平衡时间至少为0.5～1 h，在改变流动相时也需要0.5 h重新平衡色谱柱；②温度变化，使用柱温箱，每次实验设定一个恒定的温度，可保证所有实验的温度一致；③流动相的问题，使用的流动相预混合则要注意每次配液的准确性，即流动相中试剂比例要一致，尤其是需要调节流动相的pH值时，保证酸度计完好且精确，这样每次配制的流动相才一致[15]。

3 结语

在HPLC技术中，上述故障的发生非常普遍，而针对这些故障发生的原因，结合HPLC仪管理经验，提出行之有效的解决办法。贵重仪器常见故障的及时排除，可提高大中型仪器完好率，从而提高仪器的使用率，保证科学研究和教学工作的正常进行。高度重视对HPLC仪的保养和维护，可延长仪器的使用寿命，能够有效发挥仪器的最大效益，更好地为科研和教学服务[16-17]。

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Application analyses of high performance liquid chromatography

SONG Xue-ying, YANG Hua, ZHAO Yi-song, et al// China Medical Equipment,2015,12(1):29-31.

Objective: To solve the difficulties and problems in the process of using high performance liquid chromatography. Methods: Summarizing the problems often occurred in this technology and providing some simple and effective solutions. Results: The instrument intact rate and utilization rate have been improved, which guarantees the scientific research and teaching. Conclusion: Proper maintenance of high performance liquid chromatography can prolong their service lives, and give play to their greatest benefits.

High performance liquid chromatography; Problems; Solutions

宋学英,女,(1964- ),大专，副主任技师。首都医科大学医学实验与测试中心现代药学研究测试室，从事高效液相色谱管理工作。

1672-8270(2015)01-0029-03

R197.39

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.01.009

2014-03-18

北京市教委科技计划(KM201310025006)“冬凌草水溶性组分的整体代谢谱及其结构分析”；北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目(CIT&TCD201304191)“基于LC-MS/MS指纹图谱的冬凌草水提取物的代谢物组学研究”；首都医科大学校长研究基金(14JYY016)“跨学科立体化的医学基础化学综合性实验项目的设计、开发与实践”

①首都医科大学医学实验与测试中心现代药学研究测试室 北京 100069

②首都医科大学化学生物学与药学院 北京 100069

*通讯作者：jingcht@ccmu.edu.cn